奶牛不孕症临床调查与益母草—丹参对CdCl_2诱导的大鼠不孕症治疗研究

【摘要】奶牛繁殖性能是影响产奶量、增加淘汰率和配种成本、降低犊牛销售利润的主要因素,产后正常受孕可实现牧场收益最大化。近几十年来,奶牛育种选育过多注重产奶量,有导致奶牛繁殖性能下降的趋势。奶牛繁殖性能低降的相关诱发因素有很多,包括遗传因素、环境因素、管理因素及其相互作用等,临床上很难确定影响奶牛繁殖性能下降的具体因素。本论文拟以奶牛场不孕母牛为研究对象,利用免疫组织化学和生物学方法,分析卵巢基质金属蛋白酶(MMP)-1,2、血清一氧化氮(NO)和生殖相关激素水平间的关系；利用氯化镉(CdCl2)中毒诱导建立雌性大鼠不孕症模型,探讨中药益母草和丹参提取物对大鼠不孕相关活性物质的影响,旨在为临床诊断和治疗奶牛不孕症提供科学依据。1.繁殖性能低下奶牛基质金属蛋白酶、抑制素、一氧化氮和生殖激素水平间的关系研究从奶牛场选取了40头母牛,其中21头为不孕母牛,19头为健康母牛,纳入母牛处于同一发情周期。尾静脉采血,利用ELISA方法对血清中的LH、FSH、E2、睾酮、抑制素(A和B)和NO进行测定,用免疫组化法和荧光定量PCR分别检测了卵巢组织中MMP-1和MMP-2的分布及其表达水平。结果表明,与健康母牛比较不孕母牛血清中LH(17.60±0.65vs.12.25±0.32；P<0.05)、E2(82.53±6.49vs.49.70±8.08；P<0.05)、NO(15.53±1.42vs.9.76±1.10；P<0.05)、抑制素A(12.25±0.32vs.17.60±0.65；P<0.05)和抑制素B(49.70±8.08vs.82.53±6.49；P<0.05)呈显著下降趋势,而FSH则呈升高趋势(P<0.05),睾酮水平各组间无显著差异(P>0.05)；PCR结果表明,不孕奶牛卵巢组织中MMP-1和MMP-2的表达水平显著降低于健康奶牛(P<0.05)；免疫组化分析结果表明,MMP-1和MMP-2分布在卵巢组织的不同部位或细胞中,主要包括排卵前卵泡的粒层和卵泡膜细胞、小毛囊、基质细胞和血管内皮细胞的上皮滤泡细胞。上述结果提示,不孕症奶牛的发生可能与血清中LH、E2、NO、抑制素A和抑制素B下降,FSH水平升高,以及卵巢组织中MMP-1和MMP-2表达水平下降有关。2.益母草和丹参对CdCl2诱导的不孕大鼠的治疗作用研究以CdCl2中毒诱导建立Wister雌性大鼠不孕模型,探讨了益母草提取液(HL)、丹参提取液(RSM)以及益母草+丹参(HL+RSM)混合提取液(每1mL药液中含原生药0.5g)对大鼠不孕相关因子的影响作用。取72只雌性Wister大鼠,随机分为6组,正常对照组、丹参组、益母草组、益母草+丹参组、阳性对照(+)组以及空白对照(-)组,每组12只,除正常对照组外,其余各组在2个情期内,进行4次腹腔注射CdCl2。与注射CdCl2前正常状态下的大鼠比较,注射CdCl2后,受试大鼠的LH(173.93±1.77vs.236.97±2.48;P<0.05).E2(0.87±0.0209vs.1.46±0.29;P<0.05)、INH-A(82.33±2.02vs.125.71±0.88;P<0.05)、INH-B(29.43±2.07vs.50.15±2.08;P<0.05)及卵巢组织中MMP-1(0.28±0.04vs.0.89±0.037;P<0.05)、MMP-2(0.29±0.03vs.1.07±0.081;P<0.05)和Smad3(0.27±0.045vs.0.85±0.046;P<0.05)基因表达水平显著降低,表明不孕症大鼠模型建立成功；药物处理后第4天,与正常对照组相比,阳性对照(+)组、治疗组(LH、RSM、LH+RSM)及空白(-)组中大鼠血清LH、E2、INH-A和INH-B水平有显著增高,其中LH+RSM组中大鼠血清激素水平最高,但均显著低于正常对照组中大鼠血清激素水平(P<0.05)；治疗组大鼠的血清FSH水平均有降低现象,其中LH+RSM组的大鼠血清的中FSH水平下降幅度最大,但仍显著高于正常对照组(P<0.05)；治疗组大鼠卵巢组织中MMP-1,2和Smad3基因有上调趋势,其中LH+RSM组上升幅度最大高,仍代于正常对照组(P<0.05)。药物处理后第8天,阳性对照(+)组、治疗组(LH、RSM)及空白组(-)中大鼠血清LH、E2、INH-A、INH-B及卵巢组织中MMP-1,2和Smad3基因表达水平均有显著增加趋势,但仍显著低于正常对照组(P<0.05)；LH+RSM治疗组大鼠血清激素水平及卵巢组织中MMP-1,2和Smad3表达水平增幅最大,与正常对照组相比呈不显著性差异(P>0.05)；LH+RSM组大鼠血清FSH接近正常组大鼠血清FSH水平,两组间呈差异不显著(P>0.05)。结果表明,LH.RSM和LH+RSM治疗可不同程度地减轻CdCl2对雌性大鼠生殖功能的损伤,其中LH+RSM效果优于二者单独使用,对不孕症大鼠血清中LH,E2、INH-A、INH-B及卵巢组织中MMP-1,2和Smad3基因表达水平有较好调节作用。综上所述,不孕症奶牛血清中LH、E2、抑制素A、抑制素B和总NO水平会明显下降,FSH水平升高,卵巢组织中MMP-1和MMP-2表达水平下降,表明奶牛繁殖性能低下与卵巢及卵泡发育异常有关,且与机体E2、INH-A、INH-B及血清中总NO水平呈现正相关性；CdCl2中毒可诱导雌性大鼠生殖功能紊乱,是建立不孕症动物模型的有效方法；中药RSM和LH+RSM对CdCl2中毒引进的雌性大鼠生殖功能损伤有治疗作用,LH+RSM组成的复方制剂效果优于两种中药单独使用,治疗后血清中LH、E2、INH-A、INH-B及卵巢组织中MMP-1,2和Smad3基因表达水平均趋向正常水平,LH+RSM合剂有望开发为防治生殖功能低下的中药组合物,其对奶牛临床不孕症的治疗作用有待进一步研究。
【作者】AliMahdiMutlag；
【导师】杨志强；
【作者基本信息】中国农业科学院，基础兽医学，2014，博士
【关键词】基质金属蛋白酶；一氧化氮；不孕；奶牛；益母草；丹参；Smad3基因；氯化镉；

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