Lixisenatide对淀粉样β蛋白所致大鼠认知障碍的拮抗效应研究

【摘要】阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD),又称老年痴呆,是一种慢性、原发性中枢神经系统退行性疾病。临床表现以进行性认知功能障碍和学习记忆能力丧失为主要特征,晚期将出现严重的痴呆。AD最典型的病理特征之一就是脑内出现高密度的以淀粉样p蛋白(amyloidprotein,Aβ)为核心的老年斑。Ap是淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)在β分泌酶和γ分泌酶的作用下水解生成的。AD病变主要累及脑内与学习和记忆等涉及认知功能的相关区域,尤其是海马和颞叶皮层。目前,关于Ap的神经毒性作用已有广泛报道。无论在体还是离体研究都表明：Aβ能够引起动物空间学习和记忆行为受损、脑内神经突触可塑性降低和培养的神经细胞凋亡等。因此,AD发病机制的“Ap学说”已被广泛认可。然而,由于Aβ的神经毒性作用所涉及的细胞机制和分子机制比较复杂且未被详细阐明,迄今为止对抗Ap的药物研究仍然没有突破性进展。寻找有效拮抗Aβ神经毒性作用的药物,已成为治疗AD的一个关键所在。值得注意的是,已有大量流行病学调查显示,另一种与年龄相关的退行性疾病—II型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)与AD有着极其密切的相关性,表现为：两种疾病在发病过程、病理变化和临床表现等方面均有着高度惊人的相似性。由此,近年来提出一个治疗AD的新策略和新思路就是：利用控制T2DM的药物来减少Aβ的产生和聚集、增强Ap的降解和清除以及拮抗Ap的神经毒性,从而达到预防和治疗AD的效果。胰高血糖素样1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是一种促胰岛素分泌的激素。由于GLP-1能够以葡萄糖依赖性的方式发挥促进胰岛素分泌的作用,所以不会引起正常人血糖水平的改变。正是因为这个优点,GLP-1已成为目前治疗T2DM的最新型和最有潜力的药物。有趣的是,GLP-1及其受体(glucagon-likepeptide-1receptor,GLP-1R)也表达于脑内很多的与认知功能相关的区域,尤其是海马。特别是已有实验证实,GLP-1能够降低脑内的Ap水平,抵抗细胞凋亡和发挥神经营养因子样的作用。然而,目前为止,GLP-1的神经保护作用仍缺乏完整的在体实验证据；GLP-1能否拮抗Ap引起的认知功能障碍,能否逆转Aβ引起的海马突触可塑性损伤目前仍不清楚；GLP-1发挥神经保护作用所涉及到的可能机制也有待深入研究；尤其是,由于天然的GLP-1可被二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidase-4,DPPIV)裂解,故半衰期仅有1～2min,这使得GLP-1在AD治疗中的应用受到了极大限制。Lixisenatide是一种新型的GLP-1类似物,它不仅能够抵抗DPPIV的裂解,使得半衰期较长,而且与GLP-1R的亲和力是天然GLP-1的4倍,生物活性较高。因此,本研究系统探讨了GLP-1类似物Lixisenatide的神经保护作用及可能机制。研究主要分为以下三个部分：(1)采用Morris水迷宫(Morriswatermaze,MWM)技术,观察双侧海马内注射lixisenatide,是否可以有效拮抗Aβ25-35诱导的大鼠空间学习和记忆能力的障碍；(2)采用在体大鼠海马CA1区场电位的电生理技术,观察了双侧海马内注射lixisenatide是否可以有效逆转Aβ25-35引起的长时程增强(Longtermpotentiation,LTP)的压抑；(3)采用WesternBlotting分子生物学手段,观察了lixisenatide对PI3K-AKT信号转导通路中糖原合成酶激酶3β(Glycogensynthasekinase3β,GSK3β)活性的影响,旨在阐明lixisenatide发挥神经保护作用的分子机制。第一部分Lixisenatide保护大鼠空间学习记忆免受Aβ25-35引起的损伤为了阐明lixisenatide在脑内是否能够发挥神经保护作用,我们采用Morris水迷宫(MWM)行为学方法观察了双侧海马内注射lixisenatide对Aβ25-35诱导的大鼠空间学习和记忆能力障碍的影响。实验选用反应灵活、无视觉和运动障碍的雄性SpragueDawley(SD)大鼠。SD大鼠被麻醉后,在脑立体定位仪的引导下,应用微量注射泵将药物缓慢注入双侧海马内。待大鼠清醒并恢复约两周后,进行MWM行为学测试。该测试分三部分进行：定位航行实验、空间探索实验和可视平台实验。主要观察指标为：大鼠逃避潜伏期和游泳距离、大鼠在目标象限(即平台所在的象限)内游泳的时间和距离占总时间和总距离的百分比、大鼠游泳速度以及大鼠寻找可视平台的潜伏期。实验结果显示：(1)Aβ25-35能够显著降低大鼠的空间学习和记忆能力。双侧海马内注射5nmolAβ25-35后,在定位航行实验中,与对照组相比,从开始测试后的第2天到第5天,大鼠寻找目标平台的时间和游泳距离明显延长(P<0.05)。例如,在训练第4天时,5nmolAβ25-35处理组大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离分别为23.02±1.95s和452.90±26.31cm,明显多于对照组的16.43±1.67s和214.05±39.61cm(P<0.05)。在第6天的空间探索实验中,5nmolAβ25-35处理组的大鼠处于目标象限的时间和距离占游泳总时间和总距离的百分比分别为25.30±3.85%和25.97±3.63%,明显少于对照组的46.24±4.59%和45.71±4.25%(P<0.05)。(2)单独给予1ixisenatide对大鼠的空间学习和记忆能力的影响没有统计学差异。在定位航行实验中,5nmollixisenatide不影响大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离,与对照组相比,没有明显的统计学差异(P>0.05)；在空间探索实验中,5nmollixisenatide处理组的大鼠处于目标象限的时间和距离占游泳总时间和总距离的百分比分别为44.78±4.32%和45.46±3.47%,与对照组的46.24±4.59%和45.71±4.25%相比,也没有明显的统计学差异(P>0.05)。(3)Lixisenatide以剂量依赖性的方式保护了Aβ25-35诱发的大鼠空间学习和记忆能力的损伤。在定位航行实验中,低剂量lixisenatide处理组(0.05nmol)的大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离与单独给予5nmolAβ25-35处理组相比,无显著的统计学差异(P>0.05)；中等剂量lixisenatide处理组(0.5nmol)和高剂量lixisenatide处理组(5nmo1)的大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离与单独给予5nmolAβ25-35处理组相比,有显著的统计学差异(P<0.05)。在训练第4天,0.5nmol和5nmollixisenatide+5nmolAβ25-35处理组的大鼠的逃避潜伏期分别为：18.09±1.17s和14.78±1.13s；大鼠找到目标平台所游过的距离分别为：326.45±25.95cm和226.41±25.50cm,且呈现出一定的剂量依赖性趋势(P<0.05)。在空间探索实验中,低剂量lixisenatide处理组(0.05nmol)的大鼠处于目标象限的时间和距离占游泳总时间和总距离的百分比与单独给予5nmolAβ25-35处理组相比,无明显的统计学差异(P>0.05)。0.5nmol和5nmo1lixisenatide处理组的大鼠处于目标象限的时间占游泳总时间的百分比分别为：34.38±3.11%和42.22±3.33%；大鼠处于目标象限的距离占游泳总距离的百分比分别为：35.14±3.99%和44.42±3.41%,明显高于单独给予5nmolAβ25-35处理组(P<0.05),且随着lixisenatide浓度的增加而逐渐增大,表现出明显的剂量依赖性(P<0.05)。(4)可视平台实验显示：lixisenatide、Aβ25-35以及二者的联合应用均未影响大鼠的运动能力和视力。各组大鼠的游泳速度没有明显的统计学差异(P>0.05),基本维持于22cm/s左右。各组大鼠寻找可视平台的时间也没有明显的统计学差异(P>0.05),基本维持于15s左右。以上实验结果表明：双侧海马内注射Aβ25-35严重损害了大鼠的空间学习和记忆能力；lixisenatide能够剂量依赖性有效拮抗Aβ25-35引起的学习和记忆能力损伤。从而提示：脑内GLP-1的高表达,尤其是使用GLP-1类似物lixisenatide极有可能成为治疗AD等神经退行性疾病的一种新思路和新方法。第二部分：Lixisenatide保护大鼠在体海马长时程增强免受Aβ25-35引起的损伤本实验采用神经电生理学方法,通过记录大鼠在体海马场兴奋性突触后电位(fieldexcitatorypostsynapticpotential,fEPSP)观察了双侧海马内注射Aβ25-35和lixisenatide以及二者的联合应用对大鼠海马CA1区长时程增强(LTP)的影响作用,旨在阐明lixisenatide的神经保护作用以及探讨lixisenatide发挥神经保护作用的电生理学机制。实验采用MWM行为学测试后的大鼠,将其麻醉后固定在脑立体定位仪上,然后将绑定电极(同心圆双极刺激电极和单极记录电极)精确插入到海马的刺激部位和记录部位。通过给予海马Schaffer侧枝单个测试刺激、双脉冲刺激和—组高频刺激(highfrequencystimulation,HFS)后,在海马CA1区的放射层记录基础的fEPSP、双脉冲刺激引起的双脉冲易化(pairedpulsefacilitation,PPF)和HFS引起的LTP。实验结果显示：(1)双侧海马内注射Aβ25-35不影响基础fEPSP的幅度,但显著抑制了HFS引起的海马在体LTP。注射5nmolAβ25-35后,fEPSP的平均幅度在HFS后的30min和60min时分别为：136.66±3.41%(P<0.01)和119.01±3.82%(P<0.01),明显低于对照组的168.13±3.16%和155.65±3.48%,表现出显著的LTP抑制效应。(2)单独给予lixisenatide对基础fEPSP的幅度和HFS后引起的LTP均没有影响,与对照组相比,无明显统计学差异(P>0.05)。(3)不同浓度的lixisenatide剂量依赖性拮抗了Aβ25-35诱导的LTP损伤。HFS后的1h,三个不同浓度(0.05nmol,0.5nmol和5nmo1)的lixisenatide+5nmolAβ25-35处理组的fEPSP幅度分别为120.84±3.77%(P>0.05)、135.70±3.80%(P<0.01)和145.71±3.81%(P<0.01)。0.5nmol和5nmollixisenatide+5nmolAβ25-35处理组的fEPS的幅度均明显高于单独给予5nmolAβ25-35处理时的fEPSP的幅度(P<0.01),且随着lixisenatide浓度的升高,Aβ25-35引起[的LTP的压抑效应逐渐改善,呈现出一定的剂量依赖性(P<0.05)。(4)各组的PPF没有明显的统计学差异(P>0.05),说明各种药物对LTP的影响主要不是通过突触前机制进行的。以上电生理实验结果表明：双侧海马内注射Aβ25-35严重压抑了大鼠海马CA1区的LTP;lixisenatide可以剂量依赖性有效逆转Aβ25-35引起的在体大鼠海马CA1区LTP的抑制。可见,Lixisenatide对大鼠海马LTP的保护效应与lixisenatide对大鼠学习和记忆能力的保护作用是一致的,这在一定程度上解释了GLP-1和GLP-1类似物lixisenatide改善大鼠认知功能的细胞机制。第三部分：Lixisenatide抑制Aβ25-35诱导的糖原合成酶激酶3β的激活Lixisenatide的神经保护作用可能与PI3K-AKT-GSK3P信号转导通路有关。为了研究lixisenatide对抗Aβ引起的认知功能和长时程增强的损伤而发挥神经保护作用的分子机制,我们观察了lixisenatide和Aβ25-35处理对糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β,GSK3β)活性的影响。电生理实验结束后,大鼠的海马组织被取出,立即将其制备成WesternBlotting分子技术检测的样品。我们检测了GSK3p及其两种磷酸化形式pGSK3β(S9)和pGSK3β(Y216)的活性水平,并计算了GSK3β/β-actin,pGSK3p(S9)/GSK3p和pGSK3β(Y216)/GSK3β的比值。实验结果显示：(1)对照组、5nmolAβ25-35处理组、5nmollixisenatide处理组和5nmollixisenatide+5nmolAβ25-35处理组的GSK3β/β-actin的比值分别为：1.41±0.07、1.40±0.05、1.40±0.05和1.41+0.06。各组之间没有明显的统计学差异(P>0.05)。(2)5nmolAβ25-35处理组的pGSK3β(S9)/GSK3β比值是0.38±0.06,明显低于对照组的0.53±0.06(P<0.05)。单独给予5nmollixisenatide处理不影响pGSK3β(S9)/GSK3p)比值P>0.05),但联合应用5nmollixisenatide和5nmolAβ25-35后,该比值为0.52±0.05,明显高于单独给予5nmolAβ25-35处理时的比值(P<0.05)。说明lixisenatide能够拮抗Aβ25-35引起的pGSK3p(S9)/GSK3p)比值降低,从而抑制GSK3β的活性。(3)5nmolAβ25-35处理组的pGSK3β(Y216)/GSK3p比值是0.51±0.05,明显高于对照组的0.35±0.07(P<0.05)。单独给予5nmollixisenatide处理不影响pGSK3β(Y216)/GSK3β比值(P>0.05)。但是,5nmollixisenatide预处理后,该比值为0.36±0.06,明显低于单独给予5nmolAβ25-35处理组(P<0.05)。说明lixisenatide能够拮抗Aβ25-35引起的pGSK3β(Y216)/GSK3β比值升高,从而抑制GSK3β的活性。以上实验结果表明：lixisenatide可以有效对抗Aβ25-35诱导的GSK3β的激活,从而发挥拮抗空间学习和记忆损伤及逆转长时程增强压抑的神经保护作用。该结果提示：PI3K-AKT-GSK3β信号转导通路中GSK3p活性的降低很可能是GLP-1及其类似物lixisenatide发挥神经保护作用的重要分子机制。综上所述,本研究利用Morris水迷宫测试、电生理场电位记录和WesternBlotting技术,通过观察大鼠空间学习和记忆能力、记录在体海马LTP和检测PI3K-AKT信号转导通路中GSK3β的活性水平,阐明了lixisenatide拮抗Aβ25-35的神经毒性作用及发挥神经保护作用的细胞机制和分子机制。研究结果表明,lixisenatide能够有效对抗Aβ25-35诱导的大鼠空间学习和记忆能力障碍及在体海马LTP损害,此种神经保护作用可能与lixisenatide对突触传递的调控以及对GSK3β活性水平的影响有着紧密的联系。因此,本研究为GLP-1类似物lixisenatide的神经保护作用提供了可靠的行为学和电生理学证据,并初步揭示了可能的细胞和分子机制,为GLP-1类似物lixisenatide用于AD的临床治疗奠定了一定的实验基础。
【作者】蔡红艳；
【导师】祁金顺；
【作者基本信息】山西医科大学，生理学，2014，博士
【关键词】Lixisenatid；e淀粉样β-蛋白(Aβ)；阿尔茨海默病(AD)；Ⅱ型糖尿病(T2DM)；Morris水迷宫(MWM)；长时程增强(LTP)；糖原合成酶激酶3β(GSK3β)；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)；海马；

【参考文献】
[1]潘红.保险受益人确定问题研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[2]毛辰石.风云二号卫星精太阳脉冲信号调制度的测量[J].空间电子技术.2001(04)
[3]徐恒.面向网格计算的汽车动力学实时仿真虚拟系统框架开发[D].吉林大学,车辆工程,2004,硕士.
[4]秦东.地区电能质量监测与管理系统的设计与实现[D].四川大学,电气工程,2003,硕士.
[5]吴疆.长株潭地区森林自然度评价[D].中南林业科技大学,森林经理学,2014,硕士.
[6]孙帅.论我国环境污染事件信托基金的法律建构[D].山东师范大学,环境与资源保护法学,2013,硕士.
[7]郭晶.基因组改组选育植物乳杆菌及其对契达干酪促熟的影响[D].东北农业大学,农产品加工及贮藏工程,2013,硕士.
[8]俞婷婷,林煜轩,刘力.间接故意和过于自信的过失区分之解决方案[J].现代物业(中旬刊),2013,01:73-76.
[9]李斌.惩罚性赔偿责任的法律研究[D].北方工业大学,法学,2013,硕士.
[10]周业琼.秭归县“幸福村落”建设的运行逻辑[D].华中师范大学,政治社会学,2014,硕士.
[11]涂丹辉.固态盘的闪存转换层设计与优化[D].华中科技大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[12]李泽佳.补肾固本方对去卵巢大鼠骨生物力学及骨密度影响的实验研究[D].甘肃中医学院,中医骨伤科学,2014,硕士.
[13]任建军.TiB粉末材料抗氧化性能及杂质提纯研究[D].吉林大学,材料学,2014,硕士.
[14]朱沁.多船会遇的船舶智能避碰专家系统研究与仿真[D].武汉理工大学,流体力学,2004,硕士.
[15]江丹君.施氏矿物对小分子有机酸光化学还原Cr（Ⅵ）的催化作用研究[D].南京农业大学,应用化学,2012,硕士.
[16]吴光林.ATM在未来宽带网络中的地位[J].世界电信.1999(03)
[17]王兴元.略论《唐律》中的共同犯罪[D].青海师范大学,中国古代史,2012,硕士.
[18]汪宏年,其木苏荣.阵列感应测井资料的快速迭代反演[J].石油地球物理勘探,2002,06:644-652+660.
[19]王军利,吕志国,卜祥宝.稀土离子掺杂飞秒光纤激光器最新进展[J].激光与光电子学进展,2012,10:52-61.
[20]吴婧黁.金坛市城乡一体化发展模式研究[D].南京农业大学,农村与区域发展,2011,硕士.
[21]金晶.名利场与“桃花源”[D].安徽大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[22]李天鹤.对近三年吉林体育学院新生入学体质健康状况的比较研究[D].辽宁师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[23]曲夏夏.和谐社会构建中的生活质量问题研究[D].山东大学,政治学理论,2014,博士.
[24]成新田,唐振民.基于主动鉴别字典学习的自主导航偏离控制算法[J].控制与决策,2015,05:947-950.
[25]牧少伯.m序列的密码学特性及其应用[D].郑州大学,基础数学,2013,硕士.
[26]李雨亭.海蟒式海浪换能器建模及组合缸式液压系统控制策略研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[27]王征欧.基于“翻译目的论”视角的《搜神记》副词英译探究[D].四川外国语大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[28]陶一瑶.节能清扫车的设计研究[D].沈阳理工大学,设计艺术学,2012,硕士.
[29]陈世华.盐芥TsTRX基因的分子克隆及在盐胁迫条件下的差异表达特性分析[D].山东师范大学,发育生物学,2003,硕士.
[30]李天尚.建议面向全东北区[J].辽宁气象.1991(01)
[31]崔言飞.永磁同步电动机调速系统模糊反推控制策略的研究[D].杭州电子科技大学,控制工程,2014,硕士.
[32]周竞,陈玉娟.数据挖掘在WEB中的应用[J].内蒙古科技与经济,2004,S2:98-100.
[33]杜文龙.国道209线石壁山大桥抗冻及抗碳化性能试验研究[D].内蒙古农业大学,森林工程,2013,硕士.
[34]邢启振.唐后期武宁镇战略地位研究[D].山东师范大学,中国古代史,2013,硕士.
[35]SarinSokrettsautta.Analysis of FDI in Cambodia[D].苏州大学,INTERNATIONALBUSINESS（专业学位）,2014,硕士.
[36]陈添兴.南京紫金山大型菌物多样性研究[D].南京师范大学,微生物学,2012,硕士.
[37]王春彦.股骨外旋对人工全髋关节置换术前数字化模板测量的影响[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[38]张善臣,刘凤翔.探索和改进思想政治工作保证小浪底工程建设[J].中国水利.2004(12)
[39]郎红东.土壤CO_2浓度变化及其影响因素研究[D].西南农业大学,土壤学,2004,硕士.
[40]袁文婷.试论城乡规划许可变更[D].苏州大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[41]陈青松,沈江,徐曼,孙志敏,齐二石.基于虚拟企业的企业技术创新模式及其应用[J].西安工程科技学院学报,2005,02:192-196.
[42]李哲萍.FOLFOX4联合1-MT对胃癌小鼠脾脏树突状细胞表面分子的影响[D].山西医科大学,内科学,2013,硕士.
[43]戴连奎,吕勇哉.分散控制系统结构的综合及其工业应用[J].自动化学报,1991,03:296-303+384.
[44]赵英伟.继发性膝关节骨坏死外科与保守治疗效果对比[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[45]周波.初中生人格特质与学业拖延的相关研究[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[46]杨君,刘志敏,展海军,王珍玲.石墨烯-纳米金复合物修饰电极用于异烟肼及抗坏血酸的同时测定[J].分析测试学报,2014,04:403-408.
[47]臧文利,郭治,王远钢.随机系统中满意PID调节器的设计[J].控制与决策,2005,11:116-118.
[48]陈秀春.基于.NET平台变电所设备管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[49]赵玉珍,许克毅.关于研究生教育收费改革的思考[J].中国高教研究.2003(11)
[50]张艺.艺术品投资基金投资组合风险研究[D].中央美术学院,艺术管理,2013,硕士.