组蛋白脱乙酰基酶-4治疗骨关节炎的机制研究

【摘要】研究背景骨关节炎是中老年人的常见病,往往伴随着不可逆转的关节软骨损伤。目前,骨关节炎的病理机制仍然不明确,因此,并没有有效的方法可以抑制关节软骨的退变和治疗关节软骨损伤。在骨关节炎的发病过程中,关节软骨中的软骨细胞发生了肥大样改变,其过程类似于胚胎生长过程中的软骨内成骨。使用基因修饰的方法刺激关节软骨细胞的肥大样改变的过程,可以提高骨关节炎的发病率或者加速骨关节炎的病理过程。抑制关节软骨细胞的肥大样改变可以有效的预防和治疗骨关节炎。因此,从抑制软骨细胞肥大样改变的途径寻找治疗骨关节炎的基因或者药物,可能是治疗骨关节炎非常有效的方法。组蛋白脱乙酰基酶-4(HDAC4)是II类组蛋白脱乙酰基酶家族的成员之一。它可以通过抑制具体的靶转录因子来调控核小体的结构,进而控制细胞的增殖与分化。使用基因工程的小鼠,敲除组蛋白脱乙酰基酶-4可以导致软骨细胞肥大提前发生,进而导致正在生长中的骨骼过早钙化成熟。但是,在处于增殖期的软骨细胞中过表达组蛋白脱乙酰基酶-4可以抑制软骨细胞肥大的过程。进一步的研究证明：组蛋白脱乙酰基酶-4抑制软骨细胞肥大的过程是通过抑制Runx2实现的。Runx2是Runt蛋白相关转录因子-2,它可以控制软骨细胞肥大,在软骨细胞肥大的过程中起着关键性的作用。软骨细胞肥大是内源性骨形成过程的关键一环。在内源性骨形成的过程中,处于不同时期的软骨细胞均有其特征性的生物学标志物。例如：增殖期的软骨细胞的标志物是Sox9或者CollagenⅡ、肥大前的软骨细胞的标志物是Ihh、肥大期软骨细胞的标志物是typex和MMP-13.综上所述：我们能够得出：1),关节软骨细胞肥大样改变,是骨关节炎关节软骨退变的重要病理机制之一；2),抑制关节软骨细胞肥大样改变可以预防和治疗骨关节炎发生时的关节软骨退变；3),在骨关节炎发病的过程中,关节软骨细胞的肥大样改变过程类似于内源性骨形成过程中的软骨细胞肥大；4)组蛋白脱乙酰基酶-4可以通过抑制Runx2的转录活性抑制软骨细胞的肥大过程,但是,在骨关节炎发病过程中所担当的角色目前尚不清楚。因此,为了探索组蛋白脱乙酰基酶-4是否可以预防和缓解骨关节炎发病过程的关节软骨退变,我们打算从三个方面展开实验。1),收集人类膝关节软骨标本,并检测：HDAC4、Runx2、Typex和MMP-13在损伤程度不同的人类关节软骨标本中的变化趋势；2),构建人类HDAC4蛋白的腺病毒表达载体,并在体内外感染关节软骨细胞。通过直接观察GFP或者免疫荧光或westernblot实验,探测腺病毒表达载体是否可以成功把人类HDAC4基因带入软骨细胞中并且可以成功表达目的蛋白；3),使用前交叉韧带切断的方法构建大鼠骨关节炎动物模型,在术后一周将腺病毒表达载体注射到大鼠关节腔内,动物饲养3月后取材,分析实验结果。材料和方法(1),体外取人类膝关节OA行全膝关节置换术后的胫骨平台标本(N=15),并将非附中区的残留软骨组织较好的样本,定义为相对正常的样本；将软骨组织损伤严重的区域,定义为骨关节炎样本；年龄匹配的正常的胫骨平台软骨组织样本取自临床收集的因严重的外伤而截肢的患者(N=7)。(2),每组样本的软骨均制作6-um的切片行番红O染色,并对染色的结果使用Mankin评分进行定量。(3),使用westernblot的方法对不同组别内的HDAC4,及其靶蛋白Runx2、Typex和MMP-13进行分析,并对其所得条带的灰度值进行定量分析。使用RT-PCR方法检测SD大鼠OA膝关节软骨样本和正常膝关节软骨样本内的HDAC4mRNA。(4),体外构建人类HDAC4腺病毒表达载体,并感染体外培养的大鼠膝关节软骨细胞,感染48小时后,使用荧光显微镜观测GFP表达及取其细胞裂解液进行westernblot分析。在向大鼠关节腔注射病毒载体2周后,免疫荧光的方法检测HDAC4在大鼠膝关节软骨中的表达。检测人类HDAC4腺病毒表达载体在体内是否可以成功大鼠膝关节软骨细胞及可以成功表达目的蛋白。(5),将印度墨水向大鼠关节腔注射,验证我们的注射方法是否可以成功向关节腔内进行注射。(6),使用前交叉韧带切断的方法制作SD大鼠OA动物模型,并将实验动物70只分为5个组(每组12只)：ACLT(骨关节炎组)、ACLT+Ad-GFP(骨关节炎加关节腔内注射空病毒载体)、ACLT+Ad-HDAC4-1[骨关节炎加术后一周关节腔内注射人类HDAC4腺病毒载体1次(2x108PFU)]、ACLT+Ad-HDAC4-3[骨关节炎加术后一二、三周分别关节腔内注射人类HDAC4腺病毒载体3次(3x108PFU)]、Sham(假手术组)。(7),术后3个月取材检测指标(需要进行Brdu检测的实验动物,术前2天腹腔注射Brdu试剂)：1),每组3只动物印度墨水染色行大体形态学观察；2),每组3只动物膝关节软骨标本行病理切片番红O染色；3)每组3只动物取关节软骨组织,提取总RNA行RT-PCR分析；4),每组3只动物取膝关节软骨标本行Brdu、Runx2、Typex、MMP-13免疫组化染色。定量结果用均数±标准差表示,统计学分析使用SPSS13.0软件采用One-WayANOVAtest检验,P<0.05为有统计学意义。结果Westernblot显示：在人类膝关节软骨标本中,随着软骨损伤Mankin评分的逐渐升高,HDAC4的表达逐渐下降。但是Runx2、Typex和MMP-13的表达在逐步上升。在大鼠膝关节软骨组织中：与正常的软骨组织相比,OA软骨中的HDAC4mRNA下降是非常明显的。在荧光显微镜下,GFP阳性染色及HDAC4免疫荧光染色显示：在体内外,人类HDAC4基因腺病毒载体可以高效感染大鼠膝关节软骨细胞。Westernblot结果显示：在体外大鼠膝关节软骨细胞中,人类HDAC4基因腺病毒载体可以表达目的蛋白。大体图片显示：使用印度墨水染色和Meachim评分,ACLT、ACLT+Ad-GFP和ACLT+Ad-HDAC4-3三组的印度墨水染色及评分是相同的(P>0.05)。但是,与ACLT组相比,ACLT+Ad-HDAC4-1组染色及评分明显较低(P<0.05)。BrDU染色显示：ACLT组与ACLT+Ad-GFP组的阳性细胞比率是相同的,但是ACLT+Ad-HDAC4-1组和ACLT+Ad-HDAC4-3组的阳性细胞比率明显较ACLT组高(P<0.05)。TUNNEL染色结果与BrDU染色结果是相反的。Runx2、MMP-13和Typex免疫组化染色结果显示：ACLT组与ACLT+Ad-GFP组的阳性细胞比率是相同的,但是ACLT+Ad-HDAC4-1组和ACLT+Ad-HDAC4-3组的阳性细胞比率明显比ACLT组低(P<0.05)。RT-PCR结果显示：Aggrecan,Sox9、Col-2、Runx2、Typex,MMP-13、大鼠内源性的HDAC4和Ihh在ACLT组与ACLT+Ad-GFP组中的表达是相同的,Aggrecan、Sox9、Col-2、Runx2、RatHDAC4和Ihh基因在ACLT+Ad-HDAC4-1中的表达是最高的,且与ACLT组相比(P<0.05)但是,Runx2、Typex和MMP-13基因在ACLT+Ad-HDAC4-1组和ACLT+Ad-HDAC4-3组表达下降(P<0.05)。结论(1)在软骨细胞内过表达HDAC4,可以通过促进软骨细胞增殖,抑制软骨细胞凋亡和软骨细胞肥大样改变,进而起到对关节软骨组织的保护性作用；(2)在ACLT诱导的大鼠OA模型中,]3DAC4可以作为缓解软骨退变的治疗靶点。
【作者】张聪明；
【导师】魏垒；
【作者基本信息】山西医科大学，骨外科学，2014，博士
【关键词】关节软骨；脱乙酰基；腺病毒载体；cartilage；关节腔内注射；大鼠；软骨组织；表达载体；articular；阳性细胞；

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