转SHH基因的骨髓间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤的实验研究

【摘要】由于交通事故、外伤、塌方、自然灾害等原因导致的脊髓损伤（Spinalcordinjury,SCI）一直是医学界的难题之一。脊髓损伤可以导致神经细胞的缺失，破坏神经传导，进而引起许多组织、器官功能障碍，是最常见的一种致残、致死率性疾病。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担，严重影响人类生活质量。目前脊髓损伤的主要治疗方法包括手术解除压迫、类固醇、蛋白激酶、金属蛋白酶抑制和再生技术等，但是治疗效果有限。近年来，关于脊髓损伤后的修复治疗研究取得了很大进展，其中干细胞基因疗法移植治疗是公认的有希望的治疗方法，是目前治疗脊髓损伤的研究焦点。研究表明骨髓间充质干细胞具有来源广泛、具有良好的增殖和分化能力、易于获得和培养、免疫排斥反应低，而且不涉及伦理问题，是理想的基因治疗的载体。在治疗脊髓损伤方面，骨髓间充质干细胞可以分泌神经营养因子，改善脊髓损伤的微环境；具有桥接作用，可以为轴突再生提供一个很好的连接通道；可以促进新生血管的形成并对损伤部位进行靶点归巢。然而由于脊髓损伤后局部缺血、低氧等微环境的改变，骨髓间充质干细胞移植后不能很好的存活，这极大程度上限制了它的应用。生长因子对于脊髓损伤的修复必不可少。音猬因子（Sonichedgehog，Shh）是胚胎发育过程中由脊索产生的一种因子，作为一种重要的调控因子Shh参与了调控了神经系统的发育和分化过程。当前研究表明Shh信号途径在胚胎干细胞分化为神经系统的过程中是必须的。它在以下方面对脊髓再生产生作用：音猬因子可以诱导干细胞生成运动神经元和少突胶质细胞,提高骨髓间充质干细胞分泌神经营养因子,促进神经元的存活和促进轴突的生长,阻碍星形胶质细胞的生成。然而因为Shh的快速清除性，Shh蛋白的注射并不能对脊髓损伤功能恢复产生很好的效果。在我们的实验中，我们使用转染音猬因子基因的骨髓间充质干细胞来治疗脊髓损伤，它可以持续稳定的分泌和表达Shh，尝试着解决音猬因子快速清除性和骨髓间充质干细胞的生存问题，进而可以很好的促进脊髓损伤后功能的恢复。本实验从细胞研究及动物实验两个方面进行了相关工作。研究内容主要包括以下三个部分：1提取骨髓间充质干细胞并进行培养和鉴定。2构建Shh载体，采用慢病毒技术转染骨髓间充质干细胞并进行鉴定。3制作大鼠脊髓损伤模型，通过蛛网膜下腔注射转Shh的骨髓间充质干细胞，观察脊髓损伤后的修复效果。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定研究目的建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养，并进行细胞形态学、细胞增殖、细胞表面标记物、成骨成脂诱导分化的鉴定。研究方法1.实验动物健康雌性SpragueDawley（SD）大鼠，体重160-200g,由北京军事医学科学院动物实验中心提供。2．大鼠骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）的原代分离培养10%水合氯醛腹腔麻醉SD大鼠，无菌条件下快速取大鼠的股骨及胫骨，PBS清洗干净。用剪刀剪掉长骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有100U/ml青、链霉素的L-DMEM培养基将骨髓冲出，直至骨髓腔发白；将冲出的骨髓内容物制成单细胞悬液，1200r/min离心5分钟，弃去上清，重悬细胞置于SDMSC完全培养基中生长，接种浓度为6-8×l06/ml，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中。3.BMSCs的纯化及传代在原代培养过程中，48小时后半量更换培养基，以后每3d全量更换含有10%胎牛血清的L-DMEM培养基，当细胞铺满培养皿约80%时，使用胰酶-EDTA溶液消化，1:3的比例进行传代培养。4.BMSCs的形态学检查培养后使用倒置显微镜观察贴壁细胞的形态变化以及生长情况，并进行拍照。5.MTT法检测细胞增殖能力取生长状态良好的SD大鼠BMSCs传至3代并接种于96孔培养板中，接种密度为5×103/孔，将细胞培养板置入浓度为5%的CO2培养箱中培养。每日取出一板采用MTT法进行检测。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上连续7日测定各孔光吸收值，并记录结果。以观测时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。6.流式细胞术测定BMSCs的细胞表面标记物表达取第3代生长状态良好细胞，胰酶-EDTA溶液消化，4°C离心，1200r/min，5min，计数细胞，各管依次加入单克隆抗体CD29,CD34,CD44,andCD45。室温孵育30min，PBS液洗涤细胞3次，除去未结合抗体，与FITC标记和PE标记的二抗避光作用30min，PBS液重悬细胞并置于冰上，流式细胞仪进行检测分析。7.BMSCs的成骨成脂诱导分化能力取第3代BMSCs，接种于6孔的细胞培养板中，待贴壁细胞密度达到80%时，在各诱导孔的完全培养液中分别加入成骨细胞诱导剂和成脂细胞诱导剂，各诱导孔每3天换液1次，同时设置未加诱导培养液的细胞培养孔作为空白对照。成骨细胞诱导剂诱导28天后，室温下40g/L多聚甲醛固定10分钟，然后对诱导分化的成骨细胞进行茜素红染色；成脂细胞诱导剂诱导23天后，40g/L多聚甲醛固定，然后对诱导分化的脂肪细胞进行油红O染色。倒置显微镜观察并拍照。结果1.BMSCs的形态学观测SD大鼠骨髓间充质干细胞形态以梭形细胞为主，呈放射状细胞集落单位排列，细胞生长良好，可持续稳定传代10代以上。2.BMSCs的细胞生长曲线细胞生长曲线显示BMSCs符合正常细胞生长特征并且生长活跃。3.BMSCs表面标记物的表达第3代骨髓间充质干细胞CD29，CD44均呈阳性表达，而CD34，CD45呈阴性表达。4.BMSCs成骨成脂诱导分化鉴定成骨、成脂诱导分化后，茜素红染色和油红O染色均呈阳性。小结全骨髓贴壁培养法操作步骤简单，能够大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，获得的细胞具有骨髓间充质干细胞的生物学特性，经诱导分化培养后具有成骨成脂分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为基因工程提供充足的载体细胞来源具有重要的现实意义。第二部分构建转音猬因子基因的骨髓间充质干细胞和鉴定研究目的以慢病毒为载体，体外构建音猬因子基因转染的骨髓间充质干细胞，并对转染细胞的转染效率进行鉴定，为干细胞移植治疗脊髓损伤提供稳定可靠的细胞来源。研究方法1.构建大鼠音猬因子（Sonichedgehog，Shh）的载体首先利用重叠PCR扩增attB1-Shh-attB2；然后利用GatewayTechnology构建pDown-Shh；最后使用GatewayTechnology构建pLV.EX3d.P/puro-EF1α>Shh>IRES/DsRed（redfluorescentprotein，红色荧光蛋白）Express2。2.构建Shh慢病毒并利用其感染BMSCs在脂质体Lipofectamine2000作用下转染293T细胞，逐孔滴度稀释法检测慢病毒滴度；以Shh慢病毒感染BMSCs，并通过荧光表达法判定Shh转染情况。3.Real-timePCR测定转染细胞Shh的mRNA表达细胞组织总RNA提取后，按照说明书将提取的RNA在一定的化学反应体系以及反转录条件下合成cDNA,在Real-timePCR仪上进行扩增，记录Ct值、扩增曲线以及溶解曲线。并相对定量计算实验结果（2-ΔΔCT）。4.Westernblot测定转染细胞Shh的蛋白含量细胞组织提取蛋白质后，用BCA法测定蛋白浓度。配置12%凝胶，上样、电泳、转膜、封闭、一抗反应、二抗反应，化学发光检测。结果1.构建转音猬因子基因的骨髓间充质干细胞构建音猬因子的重组慢病毒载体，经酶切及测序方法鉴定完全正确，可以转染293T细胞并表达，滴度为2-4×108TU/ml，转染BMSCs5日后红色荧光蛋白表达显著增强。2.转Shh基因的骨髓间充质干细胞Shh表达增高同未转染Shh的骨髓间充质干细胞相比，Shh慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达ShhmRNA和蛋白。小结成功构建Shh的慢病毒，然后将Shh基因成功转染至BMSCs基因组中，导致Shh的持续稳定高水平表达。为接下来的体内实验提供了基础。第三部分音猬因子转染的骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的效果研究目的建立统一的大鼠脊髓损伤模型，然后在大鼠脊髓损伤后的7天将转音猬因子（Sonichedgehog，Shh）的骨髓间充质干细胞移植入大鼠脊髓损伤模型，观察骨髓间充质干细胞的存活情况和脊髓损伤的运动功能的恢复。研究方法1.实验动物健康雌性SpragueDawley（SD）大鼠，体重200-220g,由北京军事医学科学院动物实验中心提供。2.建立大鼠脊髓损伤实验动物模型实验动物10%水合氯醛麻醉（0.3ml/100g,腹腔注射）；然后采用改良的ALLEN打击法。以T10为标志，行椎板切除术，暴露脊髓硬膜囊，垫一塑料垫片，将10g中的打击杆自25mm高度下落25mm(打击杆底部直径2.5mm)撞击脊髓。3.蛛网膜下腔注射转音猬因子的大鼠骨髓间充质干细胞（Shh-BMSCs）治疗脊髓损伤在脊髓损伤造模成功后7天，在大鼠L4节段咬除椎板，通过蛛网膜下腔将Shh-BMSCs移植入大鼠脊髓损伤模型，注射BMSCs和PBS作为对照。4.Shh-BMSCs治疗脊髓损伤后Shh的蛋白测定大鼠脊髓损伤治疗后28日，通过Westernblot法检测脊髓组织Shh蛋白水平的变化。5.Shh-BMSCs对脊髓损伤大鼠神经保护作用的测定5.1神经营养因子的表达大鼠脊髓损伤治疗后28日，通过Westernblot法检测脊髓组织成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子蛋白水平的变化。5.2BMSCs的存活情况大鼠脊髓损伤治疗后28日，损伤中心冰冻切片使用荧光显微镜观察，ImageJ软件进行BMSCs数量的分析5.3神经丝蛋白200（NF200）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光染色的测定大鼠脊髓损伤治疗后28日，损伤中心周围2mm的冰冻切片进行免疫荧光染色鉴定，经过洗片、破膜、封闭、一抗孵育（神经丝蛋白200和胶质纤维酸性蛋白）、二抗孵育和DAPI染色，最后使用荧光显微镜观察。使用ImageJ软件进行荧光表达量的分析。5.4尼氏染色对脊髓前角运动神经元进行检测大鼠脊髓损伤治疗后28日，损伤中心冰冻切片进行尼氏染色，经过预热60°C1%的甲苯胺蓝染液染色40min、蒸馏水洗3次、95%酒精快速分化脱色、无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，通风橱中风干后中性树胶封片。倒置显微镜下照相并对脊髓前角运动神经元进行计数，使用ImageJ软件进行人工定量。5.5HE染色对损伤空洞进行评估大鼠脊髓损伤后28日，损伤中心冰冻切片进行HE染色，Harris苏木素染液染色7分钟，0.5％伊红(水溶性)染液染色2-4分钟，倒置显微镜下照相并对损伤空洞体积进行评估，使用ImageJ软件进行定量分析。6.Shh-BMSCs对脊髓损伤大鼠行为学影响的评定脊髓损伤术后每一周对大鼠的运动情况进行Basso–Beattie–Bresnahan(BBB)评分，总共6周。由3位实验人员了解评分标准后，采用单盲法进行评分，取测量评分的平均值。7.统计处理实验数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，BBB评分采用重复测量的方差分析。采用SPSS15.0统计软件对数据进行统计分析。P<0.05被认为具有统计学意义。结果1.脊髓损伤大鼠模型建立成功大鼠脊髓损伤后迅速出现摇尾反射，双后肢及躯体回缩，而后呈迟缓性瘫痪，表明脊髓损伤造模成功。术后腹腔注射青霉素并进行膀胱按摩。所有大鼠术后均存活。2.Shh-BMSCs促进体内Shh蛋白的表达大鼠脊髓损伤治疗28日，通过Westernblot法检测脊髓组织中Shh的蛋白表达。经过Shh-BMSCs的治疗后，Shh的蛋白水平表达增高，差异有统计学意义。3.Shh-BMSCs能够促进神经保护3.1Shh-BMSCs促进成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子蛋白的表达大鼠脊髓损伤治疗28日，通过Westernblot法检测脊髓组织中成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的蛋白表达。经过Shh-BMSCs的治疗后，成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的蛋白水平明显高于BMSCs和PBS治疗，BMSC组蛋白表达高于PBS组，差异有统计学意义。3.2Shh-BMSCs促进BMSCs的存活大鼠脊髓损伤治疗28日，在荧光显微镜下观察BMSCs的存活情况。Shh-BMSCs组BMSCs的数量明显高于BMSCs组，差异有统计学意义。3.3Shh-BMSCs促进NF200的表达，抑制GFAP的表达大鼠脊髓损伤治疗28日，通过免疫荧光法检测脊髓组织中NF200和GFAP的荧光表达。Shh-BMSCs组NF200的荧光表达水平明显高于BMSCs组和PBS组，BMSCs组NF200的荧光表达水平高于PBS组,差异有统计学意义，Shh-BMSCs组GFAP的荧光表达水平明显低于BMSCs组和PBS组，差异有统计学意义，BMSCs组和PBS组的GFAP的荧光表达差异没有有统计学意义。3.4Shh-BMSCs增加了大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动神经元的数量大鼠脊髓损伤治疗28日，通过尼氏染色检测脊髓组织中脊髓前角运动神经元的数量。同BMSCs组和PBS组相比，Shh-BMSCs组脊髓前角运动神经元数量明显增多，BMSCs组脊髓前角运动神经元数量多于PBS组，差异有统计学意义。3.5Shh-BMSCs减少了大鼠脊髓损伤后空洞的面积大鼠脊髓损伤治疗28日，通过HE染色检测脊髓损伤后空洞面积的变化。同BMSCs组和PBS组相比，Shh-BMSCs组脊髓损伤空洞面积明显缩小，BMSCs组脊髓空洞面积小于PBS组，差异有统计学意义。4.Shh-BMSCs促进运动功能的康复在BBB评分期间，从2周到6周，Shh-BMSCs组大鼠的BBB评分明显高于BMSCs组和PBS组，BMSCs组明显高于PBS组，差异有统计学意义。小结Shh-BMSCs在治疗脊髓损伤的过程中，Shh可以持续分泌，Shh表达增强，促进了BMSCs的存活，增强了神经的保护和运动功能的康复，能够促进脊髓损伤后神经功能的恢复，可以为临床治疗脊髓损伤提供更好的方法。
【作者】贾祎佳；
【导师】刘强；
【作者基本信息】山西医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】骨髓间充质干细胞；原代培养；分化；鉴定；音猬因子；慢病毒转染；脊髓损伤；蛛网膜下腔注射；BBB评分；神经保护；BMSCs存活；

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