甲氨蝶呤周期联合环磷酰胺对胶原诱导关节炎小鼠Th17/Treg细胞平衡的影响及机制研究

【摘要】背景类风湿关节炎(RA)是以慢性滑膜炎所导致的关节软骨和骨破坏为特征的系统性自身免疫性疾病。早期采用LEF和SSZ等传统DMARDs联合治疗已在全世界范围内形成共识。经十多年的临床观察,MTX周期联合CTX治疗RA不仅有效提高疗效,且能显著降低毒副作用。这一联合治疗的策略在于选择作用于不同细胞周期的药物：MTX属细胞周期特异性药物,主要作用于G1和S期；而CTX为周期非特异性药物,对GO期和增殖各期细胞均有杀灭能力。Th17细胞和Treg细胞之间的平衡可调控自身免疫和炎症,炎症与关节破坏紧密联系。最新研究证实,Th17/Treg平衡状态状态的打破及关节微环境RANKL/RANK/OPG等骨破坏相关因子的改变是RA和CIA发病的关键环节。临床表明,MTX周期联合CTX组较单用药组能明显改善RA患者关节炎症状,延缓甚至逆转骨关节破坏,且两药均为小剂量间歇投药,给正常组织器官以恢复期,明显较少不良反应。我们前期的动物实验亦观察到联合治疗能更有效下调CIA滑膜细胞突变型p53及周期蛋白D1的表达。但二者联合能否协同调节Th17/Treg细胞及相关细胞因子的平衡尚不明确。目的探讨MTX周期联合CTX协同调控Th17/Treg细胞及骨破坏相关因子平衡的具体机制,为MTX联合CTX治疗RA提供理论依据。方法本研究建立CⅡ诱导的DAB/1J小鼠关节炎模型,随机分为CIA疾病对照组(生理盐水腹腔注射)、MTX单用药组(1.5mg/kg,每周两次,腹腔注射)、CTX单用药组(30mg/kg10day,腹腔注射)、MTX联合CTX组(MTX1.5mg/kg,每周两次和CTX30mg/kg/10day腹腔注射),同时设立正常对照组。首次胶原免疫4周后开始给药,分别治疗3周、7周和15周后检测相关实验室指标。通过观察各治疗组关节炎指数、足肿胀度、滑膜组织病理及血清抗CⅡ抗体水平评估CIA疾病严重程度。采用MultiplexLuminexBeads、FCM-CBA、ELISA、FCM及RT-PCR方法检测各治疗组Th细胞亚群(Th1、Th2、Thl7及Treg)及骨破坏相关因子的细胞、蛋白及基因水平的动态变化。结果①通过CIA小鼠大体评分、组织病理学评分及血清抗CIIIgG抗体水平的检测,证实MTX周期联合CTX治疗CIA较单用药组更有效,联合治疗不但能够明显改善关节炎症状,而且能够有效抑制关节破坏。②联合治疗可通过显著增加抑制物IκB-a表达,而有效调节NF-κB通路介导的Th细胞的增殖、凋亡及分化,抑制CⅡ刺激脾MNCs分泌IFN-γTNF-αIL-17、IL-6及IL-2等促炎细胞因子,更有效的恢复IL-17/IL-10比值平衡。③MTX周期联合CTX显著抑制脾MNCsCD4+IL-17+Th17细胞的相对数量,相反上调CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的相对数量,有效恢复Thl7/Treg细胞数量比值的平衡。同时,通过检测Th17和Treg细胞关键转录因子RORyT和Foxp3基因和细胞水平的表达,亦证实联合治疗较单药更有效恢复Th17/Treg平衡。此外,MTX周期联合CTX能够调节机体全身和局部细胞因子微环境,协同抑制Th17细胞相关促炎因子IL-17、IL-6及TNF-a的产生,相对转移Th17/Treg细胞平衡向以抗炎细胞因子IL-10为特点的Treg细胞。进一步分析,MTX联合CTX能够通过有效抑制STAT3通路激活,进而抑制pSTAT3蛋白/pSTAT5蛋白比值,从而更有效的恢复Th17/Treg细胞平衡。④MTX联合CTX通过有效抑制Th17细胞及相关促炎细胞因子(IL-17、IL-6、IL-1β及TNF-a)的表达,阻断IL-6/IL-17/STAT3正反馈环路,影响RANKL/RANK/OPG系统,而有效延缓软骨和骨破坏。结论MTX和CTX有协同或相加效应,联合治疗可能通过调控Th17/Treg细胞平衡而显著减轻关节炎症状和关节破坏。
【作者】罗静；
【导师】李小峰；
【作者基本信息】山西医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】胶原诱导关节炎；甲氨蝶呤；环磷酰胺；Th17细胞；Treg细胞；

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