P53/P21通过抑制TIMP-2表达促进人胶质瘤干细胞侵袭的机制研究

【摘要】背景和目的：脑胶质瘤作为侵袭性的肿瘤，约占颅内肿瘤的50%左右。肿瘤组织细胞向正常脑组织侵袭性生长是恶性脑胶质瘤的一个重要的生物学特征，这种向正常脑组织侵袭特性使得手术治疗难以根治肿瘤，并且放疗和化疗效果不佳，术后复发率高，预后较差。恶性脑胶质瘤的侵袭性生长和手术、耐药治疗抵抗机制尚不清楚。实体肿瘤在组织学具有多向的异质性,它的组成包括肿瘤细胞、间质炎性浸润和肿瘤的血管结构。现在有很多的研究表明，在肿瘤细胞中,存在一小部分的细胞亚群，它们具有干细胞特性，我们称之为肿瘤干细胞,这些细胞亚群在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用[1]。有关实验报道，如果将肿瘤细胞移植到具有免疫缺陷的小鼠模型中，只有CSCs能够促进肿瘤的产生和发展。从这些细胞中,低度恶性或部分导致肿瘤表型分化细胞才可以被诱导分化。近年来,在白血病[2]乳腺癌[3]胶质瘤[4、5]前列腺癌[6、7]结肠癌[8、9]和胰腺癌[11]的研究过程中，关于CSCs肿瘤发生发展的机制研究越来越得到重视。肿瘤干细胞概念的提出，可能会让我们对肿瘤生物学的理解和设计新的针对肿瘤生长治疗方法产生深远的影响。近几年大量的研究表明，肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSCs）在肿瘤起源与发展中起着重要作用。从过去大量的文献报道和我们近几年的研究发现，恶性脑胶质瘤中确实存在一小部分胶质瘤干细胞（gliomastemcells，GSCs），这些胶质瘤干细胞具有形成肿瘤、多向分化潜能以及自我更新的能力。但是，胶质瘤干细胞为何在侵袭性方面较胶质瘤细胞显著升高我们还不得而知。p21基因可以和p53共同构成细胞周期G1的检测站,它们可以通过因损伤后的DNA如果不经过修复则无法通过,减少了这些受损DNA进行复制和积累,从而发挥抑制癌细胞的作用。目前有研究显示P53/P21具有癌基因或抑癌基因的作用。然而，P53/P21在GSCs侵袭中的作用目前仍不十分清楚。目前发现，金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)、基质金属蛋白酶9（MMP9）、基质金属蛋白酶2（MMP2）通路在恶性肿瘤的侵袭性中发挥重要的作用。因为它们对ECM的成分具有特异的酶活性，所以MMP2和MMP9可以降解几乎所有类型的ECM。MMP2和MMP9的活化与肿瘤的侵袭和不良的预后等生物学特性相关。已往的文献报道进一步证明了通过降低MMP2和MMP9的表达，可以明显抑制肿瘤细胞的侵袭。TIMP-2作为MMP2和MMP9的天然抑制物，在许多肿瘤包括胶质瘤中表达都是降低的，但其中的原因尚不明确。我们通过计算机预测、文献的报道和生物信息学分析，我们发现TIMP-2可能是P53/P21的潜在靶基因之一。本研究中，我们首先从人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本中分离并鉴定了CD133+胶质瘤细胞，鉴定了这些CD133+胶质瘤细胞具有GSCs特性；然后，我们检测了TIMP-2MMP2和MMP9在胶质瘤细胞和GSCs中的表达；最后，我们研究了P53/P21对TIMP-2的调控作用并证明这是P53/P21促进GSCs侵袭的重要机制。材料和方法：1.从人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本中分离出CD133+胶质瘤细胞。2.从神经干细胞标记物免疫荧光染色、神经细胞球形成、多向分化潜能三个方面鉴定分选出的GSCs。3.采用Transwell体外侵袭实验检测GSCs和GCs侵袭力的比较。4.采用Transwell体外侵袭实验检测P53/P21对GSCs和GCs侵袭力的影响。5.采用qRT–PCR和westernbloting技术检测TIMP-2和其下游靶基因MMP2、MMP9在GSCs和GCs中的表达。6.采用qRT–PCR和westernbloting技术检测转染了P53/P21抑制剂后的GSCs中TIMP-2、MMP2和MMP9表达的变化。结果：1．成功从人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本分离和鉴定出表达CD133+标记物的胶质瘤细胞，这些细胞具有形成神经细胞球的能力。通过采用免疫荧光染色多向分化潜能实验方法显示，这些CD133+细胞球经诱导后可以分化成表达GFAP、β-tubulinIII的细胞。通过以上结果显示，我们分离出的CD133+细胞具有干细胞样特性。2．P53/P21对GSCs侵袭能力的作用。通过实验的数据显示，GSCs的侵袭性要明显高于GCs（P<0.05）。在转染了P53/P21抑制剂后，可见GSCs的侵袭能力明显下降（P<0.05）。3．通过实验的数据显示，无论是在mRNA水平还是蛋白水平，TIMP-2在GSCs中的表达要显著低于GCs（P<0.05），相反，MMP2、MMP9的mRNA水平和蛋白水平在GCs中的表达显著低于GSCs（P<0.05）。4．P53/P21对TIMP-2通路表达的作用。在GSCs中转染了P53/P21抑制剂后，MMP2、MMP9的mRNA水平和蛋白水平则显著下降（P<0.05），而TIMP-2的mRNA水平和蛋白水平的表达显著升高（P<0.05）。结论：本实验从人胶质母细胞瘤细胞系U87和人脑原发性胶质母细胞瘤标本中分离并鉴定出“胶质瘤干细胞样”的CD133+胶质瘤细胞，证明CD133+胶质瘤细胞具有高度的侵袭性，发现通过高表达P53/P21促进了GSCs的侵袭性，其可能的机制至少是通过下调TIMP-2、上调MMP2和MMP表达来实现的。本实验第一次揭示了P53/P21在人胶质瘤干细胞的侵袭性中的发挥着重要的作用，为认识恶性胶质瘤的侵袭性生长机制，探讨新的治疗方法提供新的证据。
【作者】傅鑫；
【导师】徐英辉；
【作者基本信息】大连医科大学，神经外科学，2014，博士
【关键词】胶质瘤干细胞；P53/P21；TIMP-2；MMP2；MMP9；侵袭；

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