白藜芦醇短时定期治疗对膀胱癌的抑制作用及其主要分子靶点

【摘要】背景与目的膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤。男性发病率是女性的3～4倍，好发年龄为50～70岁，发病高峰为65岁。随着年龄的增长，膀胱癌的发病率逐渐升高。世界范围内，2008年新诊断的膀胱癌患者约为386000例。每年因膀胱癌死亡的人数达130000之多。据信，膀胱癌患者每年的治疗费用居所有肿瘤之首，给人们的生活带来巨大的经济负担。膀胱癌已成为世界范围内的公众健康问题。膀胱癌是指发生在膀胱黏膜的恶性肿瘤，以尿路上皮癌（移行细胞癌）为主，占90%，其次为鳞癌和腺癌，分别占3%～7%和2%。约70%～85%的移行细胞癌为表浅性膀胱癌，又称为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscleinvasivebladdercancer，NMIBC），包括Ta、T1和Tis期的膀胱癌。另15%～30%的移行细胞癌为肌层浸润性膀胱癌（muscleinvasivebladdercancer），包括T2-T4期的膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌患者预后极差，几乎50%的患者5年内死于膀胱癌。临床实践中非肌层浸润性膀胱癌的一线治疗方法为经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethralresectionofbladdertumor，TURBT）。然而，TURBT术后50%～80%的患者会有肿瘤复发，10%～25%的患者复发后发展为肌层浸润性膀胱癌。术后易复发及复发后恶性程度增高是膀胱癌死亡的主要原因。为了减少肿瘤的复发及进一步恶化，膀胱内化疗及免疫治疗被广泛用于浅表性膀胱癌患者术后的治疗中。常用的膀胱内化疗及免疫治疗药物包括顺铂（cisplatin）、丝裂霉素C（mitomycinC）、卡介苗（BacillusCalmette-Guerin，BCG）、干扰素-α等。但是这些方法疗效有限且具有严重的局部损伤和全身毒副作用如出血性膀胱炎、造血和免疫功能抑制等，严重地影响了患者的生活质量。因此，寻求有效且无毒副作用的膀胱癌化疗药物迫在眉睫。白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、浆果、花生等植物中的多酚类化合物，具有多方面的生物药理活性包括抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化、心血管保护及神经保护等生物功能，具有极高的药用价值，且对机体无毒副作用。在这一点上，白藜芦醇与常规的肿瘤化疗药物相比具有独特的优势。越来越多的研究证据显示，白藜芦醇在人视网膜母细胞瘤、乳腺癌、髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤、急性淋巴细胞性白血病、前列腺癌及黑色素瘤等多种类型肿瘤中均表现出有效的抗肿瘤作用。白藜芦醇抗肿瘤作用的内在分子机制也因肿瘤细胞种类的不同而存在差异，细胞增殖和凋亡相关的多条细胞内信号转导通路如JAK/STAT3、Wnt、Notch、NF-κB、Sirt等均与白藜芦醇的抗肿瘤作用相关。关于白藜芦醇对膀胱癌的作用，有研究证明，白藜芦醇能够抑制人和大鼠膀胱癌细胞的生长且能诱导其发生凋亡。因此，白藜芦醇极有可能成为膀胱癌临床治疗中的理想化疗药物。新的膀胱癌治疗药物的研发需要体外和体内的实验模型。膀胱癌体外实验模型目前最常使用的是人膀胱癌细胞系，它不仅可用于膀胱癌发生发展分子机制的研究，也可用于评估膀胱癌治疗药物的有效性。体外实验模型的优点是实验条件易控制、易操作、耗时短及研究费用低；其缺点是细胞系由单一的肿瘤细胞构成且生长在体外，不能完全模拟膀胱癌组织本身及其所生长的体内微环境如基质及血管等，并且不能预测化疗药物的毒副作用。因此化疗药物在临床患者中使用的有效性及安全性仅靠体外研究的评估是不够的，还需要体内实验模型。体内实验模型中最常用的动物模型为小鼠或裸小鼠异种移植瘤模型。原因为这些动物体形小、繁殖周期短、遗传背景清晰、在生理和生化代谢特点方面与人类极其相似。为了更好地论证新化疗药物的有效性、安全性及了解药物的动力学特点，膀胱癌动物模型是必不可少的。鉴于此，本研究将利用人膀胱癌细胞系EJ，首先设计特定的与临床极其相关的体外实验体系、随后建立人膀胱癌异位、原位移植瘤裸小鼠动物模型从体外和体内系统两方面对白藜芦醇作为膀胱癌化疗药物的有效性及安全性进行充分论证，以期为白藜芦醇在膀胱癌临床治疗中的应用奠定科学而坚实的基础。具体研究内容包括：（1）体外培养人膀胱癌细胞系EJ，设计特定的体外实验体系模拟临床膀胱灌注的给药模式，通过多种实验技术及手段、从细胞和分子层面针对白藜芦醇抗肿瘤作用在这种实验体系中的有效性进行检测并对其抗瘤分子机制进行探讨。（2）采用皮下注射人膀胱癌细胞EJ的方式，建立膀胱癌皮下移植瘤裸小鼠动物模型，以体外实验体系中获取的实验数据为依据，通过移植瘤内直接注射一定浓度白藜芦醇的方法对移植瘤进行治疗，在体内就白藜芦醇对移植瘤生长的抑制作用及其分子机制进行检测和验证。（3）将一定数量的EJ细胞注射入膀胱壁黏膜下间隙，建立膀胱癌原位移植瘤裸小鼠模型，根据白藜芦醇在皮下膀胱癌移植瘤裸小鼠模型中得到的实验结果，采用膀胱灌注白藜芦醇的给药模式对原位移植瘤进行治疗，通过多种实验方法对白藜芦醇在膀胱癌原位移植瘤中的抗肿瘤作用及分子机制进行进一步评估和探讨。（4）通过与膀胱癌常规化疗药物丝裂霉素（MMC）的对比，评估白藜芦醇对正常小鼠膀胱黏膜的影响或局部刺激作用。材料与方法人膀胱癌细胞系EJ建立于1970年，来源于一例高侵袭性的膀胱肿瘤患者。实验所用的BALB/c裸小鼠及ICR小鼠由大连医科大学实验动物中心提供。人膀胱癌细胞系EJ培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。首先通过将人膀胱癌细胞EJ短时间内暴露于不同浓度的白藜芦醇中，建立模拟临床膀胱癌术后膀胱灌注化疗药物的体外实验体系，采用HE染色、MTT、TUNEL染色及流式细胞术等方法对短期白藜芦醇的抗膀胱癌作用进行检测和分析，并通过信号通路的抑制剂（AG490）、RT-PCR、Western-blotting及免疫细胞化学（ICC）等方法从分子水平对白藜芦醇抗膀胱癌作用的内在分子机制（STAT3及其下游靶基因c-Myc、survivin、cyclinD1及VEGF）进行阐明和探讨。随后，通过皮下注射人膀胱癌细胞EJ的方式建立膀胱癌皮下移植瘤裸小鼠动物模型，以体外实验的结果为依据，将特定浓度的白藜芦醇注射至移植瘤周围的皮下组织中以抑制移植瘤的生长速度，在此过程中测量计算对照组、实验组裸小鼠皮下移植瘤的体积，绘制移植瘤生长曲线；称量切除移植瘤的重量，绘制散点图。比较对照组和白藜芦醇组移植瘤的生长速度。通过免疫组织化学（IHC）的方法对各组皮下移植瘤中STAT3信号通路的情况进行检测。第三，将一定数量的EJ细胞注射入裸小鼠膀胱壁黏膜下间隙，建立膀胱癌原位移植瘤裸小鼠模型，采用膀胱灌注白藜芦醇的给药方式对原位移植瘤进行治疗，在此过程中通过称量各组荷瘤裸小鼠膀胱的重量，间接反映对照组和实验组原位移植瘤的生长情况；将各组荷瘤裸小鼠膀胱置入10%中性福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、制成石蜡切片，通过HE染色镜下观察各组原位移植瘤的生长情况，采用TUNEL染色对白藜芦醇组原位移植瘤的细胞凋亡情况进行检测；通过免疫组织化学的方法（IHC）对各组原位移植瘤中STAT3信号通路的情况进行检测。最后，通过与膀胱癌常规化疗药物丝裂霉素（MMC）的对比，评估白藜芦醇对正常小鼠膀胱黏膜的影响或局部刺激作用。结果一、白藜芦醇短时间隔治疗对膀胱癌细胞的抗瘤效应及其分子机制1.白藜芦醇短时间隔处理可以抑制膀胱癌细胞生长并诱导其凋亡MTT分析结果显示，白藜芦醇以时间和剂量依赖性方式抑制膀胱癌细胞EJ的增殖。同时，H/E染色和TUNEL分析的结果显示，在2h150μM和200μM白藜芦醇组中存在一定数量的凋亡细胞。另外，从流式细胞仪检测的结果也可看出，150μM和200μM白藜芦醇短期处理2小时可以引起膀胱癌细胞发生明显的S期阻滞和细胞凋亡。2.白藜芦醇短时间隔处理可有效抑制膀胱癌细胞中STAT3信号转导通路的转录和活化RT-PCR分析的结果显示，正常培养组中的EJ细胞存在STAT3的表达，经过200μM白藜芦醇短期（2小时）处理后STAT3的表达水平明显下降。免疫细胞化学染色（ICC）结果显示，正常培养条件下EJ细胞的胞浆和胞核中均存在较强的STAT3阳性染色（+++），经过白藜芦醇短时间隔处理后，细胞核中STAT3的阳性染色明显减弱（+）；而STAT3的磷酸化（p-STAT3）情况为，正常培养条件下p-STAT3的阳性染色主要位于EJ细胞的细胞核中（++），经2h200μMRes处理后细胞核中的阳性染色明显减弱（-）。与上述RT-PCR和ICC的结果相一致，Westernblotting的结果表明，2h200μMRes处理膀胱癌EJ细胞可引起STAT3和p-STAT3表达水平明显下降。通过RT-PCR、ICC及Westernblotting等方法对STAT3信号转导通路的下游靶基因（c-Myc、survivin、cyclinD1和VEGF）进行检测，结果为膀胱癌细胞EJ经2h200μMRes处理后，c-Myc、survivin、cyclinD1和VEGF的表达水平均有不同程度的下降。3.STAT3磷酸化的抑制剂AG490对膀胱癌EJ细胞的生长抑制作用免疫细胞化学染色结果显示，膀胱癌细胞EJ经50μM和80μMAG490处理后，STAT3和p-STAT3在细胞核中的阳性染色明显减少，表明AG490有效地抑制了EJ细胞中STAT3的磷酸化。与此同时，MTT的实验结果显示，AG490以剂量和时间相关性模式有效地抑制了EJ细胞的增殖。流式细胞仪的检测结果也表明，50μM和80μMAG490处理EJ细胞48小时可以引起EJ细胞发生明显的细胞周期阻滞（S期）及少量的细胞凋亡。上述结果与白藜芦醇短期处理EJ细胞的结果基本一致，只是细胞凋亡的比例有所降低（与白藜芦醇短期处理组相比）。同样，通过RT-PCR、ICC及Westernblotting等技术方法对AG490处理后EJ细胞中STAT3信号转导通路的下游靶基因c-Myc、cyclinD1、survivin及VEGF的表达情况进行进一步的分析。结果显示，与正常培养组相比，AG490处理的EJ细胞中c-Myc、cyclinD1、survivin及VEGF在转录和蛋白水平均出现不同程度的下降。二、膀胱癌皮下移植瘤裸小鼠模型中白藜芦醇的抗瘤作用及其分子机制1.采用皮下注射EJ细胞的方法成功建立膀胱癌皮下移植瘤裸小鼠模型2.在膀胱癌皮下移植瘤裸小鼠模型中，直接注射200μM白藜芦醇于移植瘤周围可以有效抑制膀胱癌移植瘤的生长从皮下移植瘤的生长曲线可以看出，在EJ细胞接种后的前8天，对照组与白藜芦醇治疗组中移植瘤的生长速度无统计学差异（P>0.05），但是在肿瘤细胞接种后的第12～28天，对照组中移植瘤的生长速度明显快于白藜芦醇治疗组（P<0.05）。各组膀胱癌皮下移植瘤重量的对比分析结果表明，白藜芦醇治疗组中移植瘤的重量明显低于对照组，具有明显的统计学差异（P=0.000）。各实验组裸小鼠携带皮下移植瘤的肿瘤负荷评估结果显示，对照组中移植瘤与体重的比值（肿瘤负荷）大多数均高于白藜芦醇治疗组，具有明显的统计学差异（P=0.000）。3.膀胱癌皮下移植瘤周直接注射白藜芦醇可抑制移植瘤组织中STAT3信号转导通路的活性免疫组织化学染色的结果显示，对照组移植瘤细胞胞浆与胞核内均存在STAT3的阳性染色，细胞核中阳性染色更强（+++）；而白藜芦醇治疗组移植瘤细胞胞核中STAT3的阳性染色明显减弱（-）。同时p-STAT3的免疫组织化学结果显示，对照组移植瘤细胞核中p-STAT3的阳性染色为（+++），而白藜芦醇治疗组移植瘤细胞核中p-STAT3的阳性染色明显减弱（-）。STAT3信号转导通路下游靶基因（cyclinD1、survivin及c-Myc）的免疫组织化学染色结果为，cyclinD1、survivin及c-Myc在对照组中移植瘤细胞的胞浆和胞核中均存在不同程度的阳性染色，而白藜芦醇治疗组中移植瘤细胞的胞浆与胞核中的阳性染色明显减弱。三、白藜芦醇短时定期膀胱内灌注对人膀胱癌裸小鼠原位移植瘤的抑制效应1.采用原位（膀胱壁）注射EJ细胞的方法成功建立膀胱癌原位移植瘤裸小鼠模型H/E染色的结果表明，通过注射人膀胱癌EJ细胞至裸小鼠膀胱壁的黏膜下间隙膀胱癌原位移植瘤的成功率为100%（20/20）。2.在膀胱癌原位移植瘤裸小鼠模型中，白藜芦醇膀胱灌注可以抑制膀胱癌移植瘤的生长并引起细胞凋亡实验结束时，通过颈椎脱臼法处死各组裸小鼠，取出裸小鼠膀胱，称其重量，通过各组膀胱的重量对其荷瘤情况进行评估，同时我们还选取同样周龄和体重的正常裸小鼠膀胱作为正常对照组。结果显示，实验对照组裸小鼠的膀胱重量大于白藜芦醇治疗组（0.03362gvs0.01625g），具有显著的统计学差异（P＜0.01），间接地反映白藜芦醇可以有效地抑制膀胱癌移植瘤的生长。取石蜡包埋的膀胱组织，制成石蜡组织切片，通过H/E及TUNEL染色对细胞凋亡情况进行检测。H/E染色结果显示，白藜芦醇膀胱灌注治疗的裸小鼠膀胱内移植瘤细胞具有细胞皱缩、细胞核固缩及染色质边缘化等细胞凋亡的形态学特征。同时TUNEL染色结果也揭示，白藜芦醇膀胱灌注治疗可引发膀胱内移植瘤细胞发生明显的细胞凋亡，凋亡指数为23.2%。3.在膀胱癌原位移植瘤裸小鼠模型中，白藜芦醇膀胱灌注可有效抑制移植瘤组织中STAT3信号转导通路的活性免疫组织化学染色的结果表明，实验对照组中膀胱癌移植瘤细胞胞浆及胞核中均存在STAT3的阳性染色，细胞核中阳性染色更强（+++），而白藜芦醇治疗组中膀胱癌移植瘤细胞中STAT3的阳性染色减弱，细胞核减弱更为明显（-）；同时p-STAT3的免疫组织化学结果显示，实验对照组中p-STAT3主要位于移植瘤细胞的细胞核中（++），而白藜芦醇治疗组中移植瘤细胞核中p-STAT3的阳性染色明显减弱。STAT3下游靶基因的免疫组织化学染色结果显示，cyclinD1、survivin、c-Myc及VEGF的阳性染色存在于实验对照组中移植瘤细胞的胞浆和胞核中，而经过白藜芦醇治疗的移植瘤细胞胞浆和胞核中cyclinD1、survivin、c-Myc及VEGF的阳性染色程度均有不同程度的减弱，细胞核中减弱更为明显。四、白藜芦醇和丝裂霉素短时定期膀胱灌注对正常膀胱黏膜影响的比较分析实验结束后，称量各实验组小鼠的体重，结果发现，白藜芦醇组小鼠的平均体重为27.2g，而MMC组小鼠的平均体重仅为18.1g（27.2gvs.18.1，P＜0.01）。同时H/E染色的结果显示，白藜芦醇组ICR小鼠的膀胱黏膜完整无损，未观察到炎性细胞浸润。同时在白藜芦醇膀胱灌注的裸小鼠原位移植瘤周围的膀胱黏膜也未见黏膜破损及炎性细胞浸润。而MMC组ICR小鼠的膀胱黏膜受到严重损伤，上皮严重脱落，黏膜充血、水肿甚至出血。结论一、体外实验体系中，白藜芦醇的短时间隔处理可以有效抑制膀胱癌细胞EJ的生长并引起肿瘤细胞凋亡。二、体外实验体系中，STAT3信号转导通路活性的抑制是白藜芦醇抗肿瘤作用的主要分子机制。三、白藜芦醇同样可有效抑制裸小鼠皮下和原位膀胱癌移植瘤组织的生长并引起肿瘤细胞凋亡。四、STAT3信号转导通路活性的抑制作为白藜芦醇抗肿瘤作用的主要分子机制在膀胱癌异位、原位裸小鼠模型中进一步被证实。五、STAT3信号转导通路参与了膀胱癌的发生发展过程。六、由于膀胱器管的特殊性，经膀胱灌注的白藜芦醇可以直接作用于膀胱肿瘤组织而无须经过体内的系统代谢，从而避开了白藜芦醇在体内生物利用度降低的问题，这使得白藜芦醇在临床膀胱癌的治疗中更具优势。七、与常规的膀胱癌术后化疗药物MMC不同，治疗剂量的白藜芦醇对小鼠的正常膀胱黏膜无明显影响，而且可以选择性地作用于膀胱肿瘤组织发挥其抗肿瘤作用。综上所述，本课题首次从临床治疗的角度、通过体内和体外两种实验体系揭示了白藜芦醇作为膀胱癌术后化疗药物的有效性及安全性，对白藜芦醇用于膀胱癌临床治疗的可行性进行了充分论证，在转化医学领域具有重要的实际应用价值。
【作者】吴茉莉；
【导师】刘佳；
【作者基本信息】大连医科大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】白藜芦醇；短期治疗；膀胱癌；皮下移植瘤模型；原位移植瘤模型；STAT3信号转导通路；生长抑制；细胞凋亡；

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