P2X7R在动脉粥样硬化中对NLRP3炎症小体的调节作用

【摘要】目的：观察P2X7R在动脉粥样硬化中的作用。探索NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化中的激活机制。研究oxLDL对P2X7R/NLRP3炎症小体的激活作用。方法：我们先通过Real-timePCR和Westernblot的方法观察了非冠状动脉疾病患者和冠状动脉疾病患者外周血单核细胞上P2X7R，NLRP3的mRNA和蛋白的表达水平，并且用ELISA检测了这两组人群血浆oxLDL和IL-1β的水平。然后我们用免疫荧光的方法观察了P2X7R和NLRP3在尸体解剖冠状动脉粥样硬化斑块中的表达和分布。为了了解巨噬细胞NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化中由P2X7R激活的机制，我们使用了特异性siRNA以及针对caspase-1和cathepsinB的抑制剂来进行研究。免疫共沉淀用来检测磷酸化PKR与NLRP3的相互作用。最后，我们还用免疫组化和免疫荧光的方法观察了P2X7R和磷酸化PKR在apoE-/-小鼠主动脉窦中的表达。结果：1.P2X7R与NLRP3在人动脉粥样硬化发展中的表达及作用。冠状动脉疾病患者（CAD）P2X7R和NLRP3的表达都显著高于非冠状动脉人群（Non-CAD）。CAD患者血浆中IL-1β的浓度也显著高于非CAD人群（28.99±5.98pg/mlvs14.76±2.96pg/ml）。CAD患者血浆中oxLDL浓度也高于非CAD患者（183.86±39.31pg/mlvs81.38±19.51pg/ml，P<0.05）。从尸检标本切片中，我们可以看到，与右冠状动脉比较，左前降支病变处呈明显呈偏心性狭窄。在左前降支动脉粥样硬化病变中亦可见大量的泡沫细胞堆积。左前降支病变处的动脉内-中膜厚度（intima-mediathickness）也明显增加。免疫荧光显示，在血管壁中CD68阳性的区域，P2X7R也有很高的表达。并且与无动脉粥样硬化斑块的右冠状动脉相比，前降支的动脉粥样硬化病变中P2X7R的表达更为强烈。而在P2X7R强烈表达的区域，NLRP3的表达也非常高。2.P2X7R在动脉粥样硬化中对NLRP3炎症小体的调节机制2.1我们用0μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml不同浓度的oxLDL去刺激THP-1巨噬细胞24小时，发现THP-1巨噬细胞释放到培养基中的IL-1β浓度逐渐增高（分别为3.80±1.05pg/ml，53.51±12.28pg/ml，139.79±34pg/ml，321.93±77.7pg/ml，P＜0.01）。THP-1巨噬细胞胞浆内表达的proIL-1β的mRNA水平和蛋白水平也逐渐被上调，并且胞浆内IL-1β蛋白水平也相应提高了。2.2100μg/mloxLDL刺激巨噬细胞24小时以后，细胞产生了大量的proIL-1β和IL-1β。并且，培养基中IL-1β的浓度也明显增加了。在同样100μg/mloxLDL刺激24小时后，THP-1巨噬细胞上P2X7R和NLRP3的mRNA和蛋白表达水平也明显提高了。2.3NLRP3被siRNA敲减以后，在oxLDL刺激下，巨噬细胞上proIL-1β的表达水平仍然很高，但是细胞产生的IL-1β水平均明显低于阴性对照组。2.4在体外实验中，我们用siRNA敲减了P2X7R的mRNA的表达后，THP-1巨噬细胞在oxLDL的刺激下产生的IL-1βmRNA水平和proIL-1β的蛋白表达水平并没有降低，不过，proIL-1β的成熟却明显被抑制了。2.5OxLDL可以促进PKR的磷酸化，同时上调了NLRP3的表达水平，并且此时产生了大量有活性的caspase-1。当P2X7R水平受到抑制以后，明显减缓了oxLDL对PKR磷酸化的调节作用。免疫共沉淀实验显示：oxLDL促使PKR磷酸化以后，大量的NLRP3与PKR结合到一起，发生了相互作用。当P2X7R被siRNA抑制以后，oxLDL诱发的PKR磷酸化水平明显降低，与PKR结合的NLRP3也明显减少，有活性的caspase-1也明显减少了。2.6在oxLDL持续作用下，THP-1巨噬细胞内由于堆积了大量的以胆固醇酯为主要成分的脂滴，转变成了泡沫细胞。但是，转染了P2X7RsiRNA的巨噬细胞内，胆固醇酯和脂滴明显较少。P2X7RsiRNA抑制了泡沫细胞的形成。3.P2X7R在apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变中的作用3.1为了明确P2X7R是否与动脉粥样硬化的发展有关，我们观察了P2X7R在高胆固醇饮食饲养的apoE基因敲除小鼠动脉窦粥样硬化病变中的表达。高胆固醇饮食12周时，在apoE-/-小鼠主动脉窦中，动脉粥样硬化斑块已经形成。动脉粥样硬化病变面积明显大于对照组。在病变区，不但有大量的泡沫细胞形成，还出现了针状的胆固醇结晶。在斑块中，P2X7R有较强的表达。特别是在新生成的泡沫细胞上，P2X7R的表达呈现出强阳性。用ELISA的方法检测了apoE-/-小鼠血浆oxLDL的水平和IL-1β的水平。结果表明，高胆固醇饮食饲养4周、8周和12周的apoE-/-小鼠血浆中的IL-1β水平显著高于对照组（51.56±13.28pg/ml，140.27±36.11pg/ml，171.34±45.21pg/ml，vs8.87±2.27pg/ml，P＜0.01）。高胆固醇饮食饲养4周、8周和12周后apoE-/-小鼠血浆中的oxLDL水平分别为2.61±0.93nmol/l，6.06±1.53nmol/l，6.93±2.12nmol/l，而正常饮食组apoE-/-小鼠血浆中的oxLDL几乎检测不到。3.2为了明确P2X7R影响apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变形成的作用机制，我们给apoE-/-小鼠从尾静脉注射携带有P2X7RsiRNA的慢病毒，来抑制小鼠体内P2X7R的作用。我们发现，与apoE-/-和apoE-/-NC组相比，apoE-/-P2X7R-/-小鼠动脉粥样硬化的发展受到了明显的抑制。apoE-/-P2X7R-/-小鼠血浆IL-1β的水平明显低于对照组和阴性对照组（apoE-/-+NC组）（81.57±25.79pg/mlvs157.33±40.01pg/ml，P＜0.05；81.57±25.79pg/mlvs160.32±35.59pg/mlP＜0.05）。3.3我们用免疫荧光的方法观察了高胆固醇饮食分别饲养2，4，8，12周的apoE-/-小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变中的PKR的磷酸化水平以及与P2X7R的关系。在P2X7R表达阳性的部位，PKR的磷酸化水平也随着动脉粥样硬化病变的发展，逐渐增高。结论：1)CAD患者外周血单核细胞上P2X7R，NLRP3和proIL-1β的表达以及血浆中oxLDL和IL-1β的水平显著高于非CAD人群。2)人巨噬细胞上高表达的P2X7R和NLRP3可能共同参与了动脉粥样硬化的发生和发展。3)在oxLDL刺激下，P2X7R通过调控PKR的磷酸化水平，影响NLRP3炎症小体的组装和激活，但P2X7R不能直接调控NLRP3mRNA和蛋白的表达水平。4)在oxLDL的作用下，P2X7R参与了THP-1巨噬细胞的泡沫化进程。5)随着apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的发展，P2X7R在动脉壁中的表达逐渐增高，血浆中oxLDL和IL-1β水平也逐渐增高；6)P2X7R参与了apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生发展。
【作者】彭旷；
【导师】曲鹏；
【作者基本信息】大连医科大学，心血管内科学，2014，博士
【关键词】P2X7R；NLRP3；炎症小体；动脉粥样硬化；固有免疫；

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