丹酚酸B在脊髓损伤中的作用及其相关机制的实验研究

【摘要】目的：目前，脊髓损伤是医学研究比较重要的领域之一，其发病率居高不下，由此而引发的高致残率以及死亡率逐渐受到国内外医学专家的热议。急性脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤两个病理过程，脊髓的继发性损伤可以很明显的加重原发性损伤，引起更为严重的神经功能障碍。脊髓原发性损伤发生时是没有任何征兆的，因此如何抑制脊髓继发性损伤已经成为脊髓损伤领域研究的主要焦点。脊髓继发性损伤的病理过程包括一系列的分子和细胞反应通路，这些分子事件导致了继发性损伤的发生和发展。自由基的过量产生是脊髓继发性损伤的原因之一。脊髓微循环障碍的发生和局部血流减少导致了自由基的过量产生，并由此引起细胞膜的脂质过氧化反应。研究表明细胞膜对于维持细胞的结构和正常新陈代谢具有非常重要的作用。在细胞膜中存在的大量不饱和脂肪酸发生氧化会导致细胞结构发生变化，过量的自由基攻击与脂质过氧化反应是造成这种现象的主要原因，甚至会导致细胞退化和坏死。急性脊髓损伤发生时神经元细胞和髓鞘亚细胞的细胞膜会发生一系列的病理改变，从而影响到细胞的正常代谢功能。炎症反应是脊髓继发性损伤中的主要因素之一，在病理学中也将其作为核心内容来进行研究。炎症反应与基因表达密切相关。NF-κB是转录因子蛋白家族成员之一，被认为是炎症基因表达的关键调节因子。其在中枢神经系统损伤过程中，可以调节多种细胞因子的表达，对炎症反应具有调节作用。通常情况下，NF-κB和IκB以复合体的形式存在于细胞的胞浆中。IKKs是NF-κB激活的主要蛋白激酶，IKKβ亚基是IKKs的主要催化亚基。它会促使细胞胞浆内的NF-κB和IκB复合体发生反应，使其具有活性，这种活化作用是通过IκB的磷酸化来完成的。当NF-κB被激活后，NF-κB的核定位位点就显露出来。在这种情况下，胞浆中的NF-κB就能够很快的进入细胞核，与特异性κB序列发生作用，这对细胞的基因转录会造成很大影响，导致基因转录发生变异，进而形成巨量的促炎因子和自由基，从而使细胞发生病变。目前SCI临床抗炎症反应药物仅有甲强龙。但甲强龙大剂量和较长时间使用常引起抵抗力下降、肝功能损害、免疫抑制、骨坏死等副作用。随着科学技术的发展，近年来多种传统中药的有效药物成分被提取出来，并广泛应用于脊髓损伤的体内体外实验，取得了良好的效果。丹参是我国传统中草药，目前其两种水溶性有效成分也已经被提取出来。这两种成分分别是丹酚酸B和丹参酮IIA。其中丹酚酸B已经在心脏缺血再灌注、脑缺血再灌注和肝脏纤维化等研究中被证实有具有抗氧化消除自由基、抗炎、抗肿瘤等药理作用。但在脊髓损伤中的作用尚不明确。本次实验我们拟通过行为学观察，来分析丹酚酸B对大鼠急性脊髓损伤后后肢运动功能障碍恢复的促进作用，并研究其在脊髓损伤中对IKK/NF-κB信号通路所具有的调节作用。分析丹酚酸B对脊髓损伤后NF-κB表达、IκB磷酸化、IKKβ激酶活性的影响。并通过对超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）的含量分析来研究丹酚酸B在脊髓损伤中的抗氧化作用。此外，还对丹酚酸B对抗凋亡基因Bc1-2和促凋亡基因Bax表达的影响进行了分析。希望通过实验证明丹酚酸B在脊髓损伤中具有消除自由基和抗炎作用，以及其在抑制神经细胞凋亡方面所发挥出的积极作用，为将来实现丹酚酸B的临床应用提供理论与实践基础。方法：1、取生长期为7周的健康雌性SD大鼠，体重范围220g-250g。利用改良Allen法制备SD大鼠急性脊髓损伤模型，以胸12椎体为目标打击位置，打击能量设置为25g*cm。2、实验中大鼠随机分为如下三组：假手术组(仅切除椎板，不损伤脊髓)、丹酚酸B治疗组（术后半小时腹腔注射丹酚酸B10mg/kg）、脊髓损伤组（腹腔注射等量PBS液）。3、观察丹酚酸B对急性脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的促进作用：实验期间术后第1日及每周进行一次BBB评分、斜坡实验和印迹实验，连续4周；术后4周进行游泳实验。4、观测丹酚酸B消除自由基以及减轻过氧化反应作用：在脊髓损伤后24小时处死动物，拟行脊髓损伤区匀浆检测的取1cm脊髓组织，拟行血浆检测的心脏取血。对血浆和损伤区组织中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和一氧化氮的含量进行检测。5、观测丹酚酸B对神经细胞凋亡的影响：在脊髓损伤后24小时将动物处死，然后取其长度为1cm的脊髓样本，运用免疫印迹分析和免疫组织化学来对脊髓损伤后的抗凋亡基因Bc1-2和促凋亡基因Bax进行分析和检测，分别得到两种凋亡基因的表达。6、观测丹酚酸B对IKKβ亚基激酶活性的影响：在脊髓损伤后12小时，将动物处死并将1cm的脊髓组织取出，通过IKKβ亚基激酶光谱法来对丹酚酸B对IKKβ亚基激酶所造成的影响进行测定。7、观测丹酚酸B对NF-κBp65和磷酸化I-κBα的表达所产生的影响，观察MPO活力的变化情况：脊髓损伤后24小时时间点将大鼠处死，以损伤区为中心取长度为1cm的脊髓样本，通过免疫组织化学和westernblot法来分析和检测损伤后脊髓组织中磷酸化I-κBα和NF-κBp65的表达，应用MPO活性检测试剂盒检测脊髓标本中MPO活性。8、观察丹酚酸B对脊髓空洞率的影响：实验4周后，处死动物取1cm脊髓组织应用HE染色分析各组脊髓空洞率。结果：1、经过连续4周的实验，BBB评分、斜坡实验、印迹实验和游泳实验结果证实：除术后第1日，在其他各时间点丹酚酸B组大鼠的后肢运动功能障碍相对于脊髓损伤组有很明显的减轻（P<0.05）。但在游泳实验中我们发现丹酚酸B对于大鼠尾部运动功能的提升是非常有限的（P>0.05）。2、术后24小时，脊髓损伤组大鼠血浆及损伤区组织中SOD和GSH-PX活性明显降低；相对于脊髓损伤组，丹酚酸B可以明显提高大鼠脊髓损伤后血浆和损伤区脊髓组织中的SOD和GSH-PX活力（P<0.05），从而通过提高抗氧化作用减轻继发性损伤。在大鼠脊髓损伤后24小时，对损伤区脊髓组织和血浆进行观察发现：相对于假手术组，损伤区脊髓组织和血浆中的NO和MDA的含量显著提升（P<0.01），丹酚酸B在大鼠脊髓损伤后能够有效降低NO和MDA的含量（P<0.05），减轻脂质过氧化反应，能够对血脑屏障形成保护，有效降低组织水肿，进而形成对神经细胞的保护。3、在脊髓损伤后12小时，脊髓损伤组中IKKβ激酶活性明显增强（P<0.05），丹酚酸B可以明显降低伤后12小时IKKβ激酶活性（P<0.05）。脊髓损伤后24小时，相较于假手术组，损伤组中MPO活性明显升高（P<0.01），丹酚酸B可以明显抑制它的升高（P<0.05）。在术后24小时，免疫组织化学检测证实：假手术组中几乎没有磷酸化I-κBα和NF-κBp65阳性细胞表达，脊髓损伤组中大鼠磷酸化I-κBα和NF-κBp65阳性细胞数明显增加（P<0.01），丹酚酸B可以明显减少脊髓组织中磷酸化I-κBα和NF-κBp65的阳性细胞表达（P<0.05）。蛋白质免疫印迹方法结果进一步验证了免疫组织化学检测的结论。同时经过连续4周实验，丹酚酸B治疗组大鼠脊髓空洞率较脊髓损伤组有了明显的降低（P<0.05）。4、在脊髓损伤后24小时，Westernblot和免疫组化两种方法都显示：相较于假手术组，Bax表达在脊髓损伤后有明显的增加（P<0.01），而丹酚酸B能够明显使Bax表达减少（P<0.05）；术后24小时，假手术组几乎没有Bc1-2表达，丹酚酸B治疗组和脊髓损伤组中Bc1-2表达量明显增加（P<0.01），丹酚酸B治疗对Bc1-2表达没有影响（P>0.05）。结论：1、经过BBB评分、斜坡实验、印迹实验和游泳实验证实丹酚酸B对急性脊髓损伤大鼠后肢运动功能障碍的恢复具有明显的促进作用。2、丹酚酸B能抑制脊髓急性损伤带来的过氧化反应，清除自由基和过氧化反应产物，从而减少神经元细胞的凋亡，保护神经功能。3、丹酚酸B在大鼠急性脊髓损伤模型中可能是通过抑制IKK/NF-kB信号通路来起到保护神经功能的作用。
【作者】荀翀；
【导师】吕德成；
【作者基本信息】大连医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】丹酚酸B；脊髓损伤；炎症；抗氧化；凋亡；

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