急性淋巴细胞白血病糖皮质激素抵抗机制的研究

【摘要】目的：通过检测急性T淋巴细胞白血病糖皮质激素（GC）耐药（CCRF-CEM-C1）和敏感(CCRF-CEM-C7)细胞株在与地塞米松共培养过程中糖皮质激素受体（GR）各亚型（GRα、GRβ、GRγ、GR-P）的表达变化和成人急性淋巴细胞白血病（ALL）患者在不同病期及不同临床预后中的GR各亚型（GRα、GRβ、GRγ、GR-P）的表达，探讨GR各亚型表达变化在ALLGC抵抗中的作用及与临床预后的关系。方法：1、选取GC耐药（CCRF-CEM-C1）和敏感细胞株（CCRF-CEM-C7）培养待检测。采用MTT法检测细胞增殖，验证C1和C7细胞对GC敏感性差异，并探寻最佳GC实验浓度。流式细胞仪检测两组细胞与GC共培养过程中的凋亡，实时荧光定量RT-PCR法检测GR各亚型的表达，探寻GR各亚型表达及GR自诱导在GC抵抗中的作用。2、收集我院住院ALL病人64例，其中B-ALL54例，T-ALL10例，男性31例，女性33例，初治20例，复发26例，完全缓解18例。参照NCCN2012ALL诊治指南，将ALL患者分为预后良好组30例，预后不良组34例。另取缺铁性贫血患者20例（男性9例，女性11例）为对照组。抽取ALL和对照组患者骨髓液，分出单个核细胞（MNC），采用实时荧光定量RT-PCR方法检测成人ALL患者在不同病期及不同分组中的GR各亚型（GRα、GRβ、GRγ、GR-P）表达情况，分析GR各亚型表达与ALL病期、临床疗效及诸多临床指标之间的关系，探寻成人ALLGR各亚型表达与GC抵抗的关系。同样方法检测对照组患者骨髓单个核细胞的GR各亚型（GRα、GRβ、GRγ、GR-P）表达情况，分析对照组和成人ALL患者GR各亚型表达的差异。结果：1、通过MTT实验证明C1和C7细胞对GC敏感性不同，C7细胞对地塞米松（DEX）的敏感性明显高于C1细胞，二者与10-7mol/L的地塞米松共培养时差异最显著。2、两组细胞与DEX共培养时，C7组细胞随着时间变化凋亡明显高于C1组细胞，差异有统计学意义。3、两组细胞与DEX共培养时，随着时间变化GR各亚型表达趋势不同，C1组细胞GR各亚型变化不明显，而C7组GRαGRβGRγ均为先升后降趋势，GRαmRNA表达在48h达最高点（72.49±3.65），GRβmRNA、GRγmRNA高峰前移，在24h达最高点(分别为0.02±0.01和5.24±0.05)，而GR-PmRNA则呈持续上升趋势（72h为12.61±0.63）。两组细胞GR各亚型表达均为GRα最高，GRβ最低，C1组细胞在24h内GRγmRNA表达略高于GR-PmRNA，此后随着时间变化GR-PmRNA逐渐高于GRγmRNA。而C7组细胞始终GR-PmRNA高于GRγmRNA。对比两组细胞在与DEX共培养过程中，GRα/GRγmRNA比值变化趋势不同，C7组在48h时明显高于C1组；GRα/GR-PmRNA比值两组变化趋势不同，C7组在24h时明显低于C1组；GRγ/GR-PmRNA比值在C1与C7两组间变化趋势相接近，C1组在24h明显高于C7组。在0h时C1组总GR值（12.62）高于C7组（4.24），但随着时间变化C7组逐渐升高且明显高于C1组，C1组则升高不明显。4、20例对照和64例成人ALL患者GR各亚型mRNA表达所占比例均为GRα＞GR-P＞GRγ＞GRβ；两组间各亚型表达差异无统计学意义。5、依据ALL病期（初治，复发和完全缓解CR）分组，GRγmRNA表达在各组间差异有统计学意义，P值0.000，余GRα、GR-P、GRβ各亚型表达在各组间无明显差别；进一步行组间分析发现CR组GRγmRNA表达（P50值15.82）明显高于复发组（P50值8.21）高于初治组（P50值1.93），P值均低于校正P值0.016。6、ALL患者中复发组总GR中位值（70.69）高于缓解组总GR中位值（48.01）高于初治组总GR中位值（34.75）。各组GR各亚型比例如下：初治组与复发组均为GRαmRNA＞GR-PmRNA＞GRγmRNA＞GRβmRNA，而CR组则为GRαmRNA＞GRγmRNA＞GR-PmRNA＞GRβmRNA。GRαmRNA占总GR比值在初治组中明显高于复发组高于CR组，差异具有统计学意义；GRγmRNA占总GR比值则与GRαmRNA相反，在初治组中明显低于复发组低于CR组，差异具有统计学意义。GRβmRNA占总GR比值在各组间差异无统计学意义。进一步分析GR各亚型之间比值发现GRα/GRβ比值在各组间差异无统计学意义。而GRα/GRγ比值在初治组高于复发组高于CR组，差异具有统计学意义。GRα/GR-P比值初治组高于复发组和CR组，差异有统计学意义。GRγ/GR-P比值在CR组高于初治和复发组，差异有统计学意义。7、分析ALL亚型对GR表达的影响，发现T-ALL总GR中位值(73.16）高于B-ALL组（42.65），但差异无统计学意义；两组各亚型表达比例均为GRαmRNA＞GR-PmRNA＞GRγmRNA＞GRβmRNA，T-ALL组GR各亚型表达除GRβmRNA外均高于B-ALL组，尤其GR-PmRNA表达具有统计学差异。两组间GR各亚型表达占总GR比值无明显统计学差异，GRα/GRβ比值、GRα/GRγ比值、GRα/GR-P比值及GRγ/GR-P比值在两组间无统计学差异。8、预后不良组中总GR中位值45.13与预后良好组总GR中位值44.83接近，各亚型表达比例均为GRαmRNA＞GR-PmRNA＞GRγmRNA＞GRβmRNA，两组总GR值及各亚型比例及GRα/GRβ比值、GRα/GRγ比值、GRα/GR-P比值及GRγ/GR-P比值相接近，无统计学差异。9、ALL患者GRαmRNA、GR-PmRNA、GRγmRNA之间呈正相关，尤其GRα与GR-P相关系数最强（r=0.916，P=0.000）；外周血HB值与GRα与GR-P值呈正相关(P＜0.05)，而外周血WBC数与GRγ呈负相关(P＜0.05)，余GR各亚型表达与血脂各值、与LDH、β2MG、患者年龄、外周血血小板数及骨髓中幼稚细胞数无相关关系。结论：1.C1、C7组细胞对GC敏感性不同，可用于研究ALLGC抵抗机制。2.基线水平的GR值对GC敏感与否意义有限，GR自诱导作用在GC敏感性中有一定作用；GC应用后GR各亚型表达变化与GC抵抗有关。3.GRαmRNA在ALLGC抵抗中起主导作用，GRβmRNA对GC抵抗意义不大。GR-PmRNA和GRγmRNA两亚型表达变化可能参与ALLGC抵抗。4.GR各亚型表达与ALL病期相关，GRα的降低，GRγ的升高与ALL缓解相关，可能有助于预测GC疗效。总GR值和各亚型的变化与ALL分型相关。5.ALL患者GRαmRNA、GR-PmRNA及GRγmRNA之间呈正相关；外周血HB及WBC可能参与调节GR亚型的表达。目的：检测急性T淋巴细胞白血病糖皮质激素（GC）耐药和敏感细胞株在与地塞米松共培养过程中BCL-2、BAX和糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白（GILZ）的表达和成人急性淋巴细胞白血病（ALL）患者在不同病期及不同临床预后中的GILZ的表达，探讨上述因素与ALLGC抵抗的关系。方法：GC耐药和敏感细胞株（CCRF-CEM-C1和CCRF-CEM-C7）培养待检测。收集我院住院ALL病人64例，其中B-ALL54例，T-ALL10例，男性31例，女性33例，初治20例，复发26例，完全缓解18例。参照NCCN2012ALL诊治指南，将ALL患者分为预后良好组30例，预后不良组34例。另取缺铁性贫血患者20例（男性9例，女性11例）为对照组。1、流式细胞仪检测两株细胞与GC共培养过程中不同时间点BCL-2、BAX和GILZ的蛋白表达，实时荧光定量RT-PCR方法检测相应时间点的GILZmRNA的表达，探寻上述因素在GC抵抗中的作用。2、抽取骨髓液，采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞（MNC），采用实时荧光定量RT-PCR方法检测成人ALL患者在不同病期及不同分组中的GILZmRNA表达，分析其与ALL病期、临床疗效及诸多临床指标之间的关系，探寻其与成人ALLGC抵抗的关系。3、同样方法检测对照组患者的GILZmRNA表达情况，分析对照组和成人ALL患者GILZmRNA表达的差异。结果：1、C1、C7组细胞在与DEX共培养过程中，C1组细胞BCL-2表达无明显变化，C7组细胞BCL-2蛋白表达逐渐下降，差异有统计学意义。2、C1、C7组细胞BAX表达随时间无明显变化，但C7组BAX表达较C1组明显增高，差异有统计学意义。3、C1、C7两组细胞GILZmRNA及蛋白表达均随着时间而增高，变化趋势相同，两组间差异无统计学意义。4、在ALL患者中，对照组的GILZmRNA(P50值526.63)明显高于ALL患者(P50值36.44)，差异有统计学意义。缓解组GILZmRNA(P50值45.51)略高于初治组(39.55)高于复发组(28.97)，但ALL患者各病期之间GILZmRNA表达差异无统计学意义。T-ALL的GILZmRNA(P50值46.28)表达高于B-ALL(P50值36.15)，但差异无统计学意义.预后良好组GILZmRNA(P50值37.37)表达略高于预后不良组(P50值36.15)，但差异无统计学意义。GILZmRNA表达与GRαmRNA，GRγmRNA，GR-PmRNA之间呈正相关。患者GILZmRNA表达与血脂、LDH、年龄、外周血WBC、HB、PLT值及骨髓中白血病细胞数之间无相关关系，与血β2MG表达有一定的正相关，但差异无统计学意义，P值0.064。结论：1.GC可通过诱导BCL-2表达下调来诱导淋巴细胞凋亡，此可能为GC诱导淋巴细胞肿瘤凋亡的机制之一。2、BAX高表达可能与ALLGC敏感有关。3、在C1,C7细胞株中GILZmRNA和蛋白均可被地塞米松诱导表达上调，但与GC抵抗无明显相关性。4、GILZmRNA可能参与GR各亚型表达的调控。目的：通过对急性T淋巴细胞白血病糖皮质激素（GC）耐药和敏感细胞株在与地塞米松共培养过程中P170表达和细胞内地塞米松药物浓度的检测，探讨多药耐药在GC抵抗中的作用。方法：选取GC耐药和敏感细胞株（CCRF-CEM-C1和CCRF-CEM-C7）培养待检测。1.流式细胞仪检测两组细胞与GC共培养过程中不同时间点P170蛋白的表达，分析其表达与GC抵抗关系。2.采用反相高效液相色谱分析法检测两组细胞与地塞米松共培养过程中不同时间点的细胞内地塞米松浓度，分析细胞内药物浓度与GC抵抗关系。3.综合分析上述两个指标变化，探讨多药耐药在急性淋巴细胞白血病（ALL）GC抵抗中的作用。结果：1、C1、C7两组细胞与10-7mol/L地塞米松共培养后，P170蛋白的表达随时间变化表现为先升后降趋势，C1组细胞P170蛋白表达略高于C7组细胞，但差异无统计学意义。2、检测两组细胞内地塞米松浓度，发现两组细胞内地塞米松药物浓度随时间延长无明显变化，虽然C7组细胞内地塞米松浓度略高于C1组细胞，但差异无统计学意义。结论：在ALLGC抵抗细胞中，多药耐药蛋白P170的表达增高，可能为细胞内药物浓度下降的原因，可能参与ALLGC抵抗。
【作者】孙秀丽；
【导师】方美云；
【作者基本信息】大连医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】糖皮质激素；受体亚型；急性淋巴细胞白血病；bCL-2；bAX；GILZ；P170；

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