改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的作用研究

【摘要】口腔医学领域很多常见病如牙周疾病、肿瘤、创伤等常常造成骨组织缺损,目前治疗骨组织缺损的方法主要有两种：自体骨移植和加工的异体或异种骨移植。近些年随着再生医学概念的确立以及组织工程技术的发展,采用患者体内来源的干细胞(种子细胞)在体外构建缺损组织,然后回植到患者体内组织缺损部位进行重建这一模式,成为解决骨组织缺损治疗难题的一个发展方向。构建组织工程骨主要包括干细胞、支架材料和促进成骨作用的生长因子。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)被普遍认为是组织工程骨的理想种子细胞,研究表明其在体外适当的培养条件下,可以向成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种间充质来源的中胚层组织细胞分化。Gronthos等于2000年利用酶消化的方法,将人类健康的第三磨牙牙髓制备成单细胞悬液并培养,得到具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞,将其命名为牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)。Miura等于2003年从脱落乳牙的牙髓中分离到具有高度增殖能力和多向分化能力的干细胞,命名为乳牙牙髓干细胞(stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth,SHED)。将SHED、DPSCs和骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)进行比较发现,三种细胞都具备间充质干细胞的特征,包括成纤维细胞样形态和表达间充质干细胞特异性表面标记物。Gronthos将DPSCs与BMMSCs进行了对比研究,在同样的接种密度下,每一万个DPSCs可形成22-70个细胞克隆,而每一万个BMMSCs仅可形成2.4～3.1个细胞克隆,说明成人牙髓干细胞具有较高的集落形成能力,并推测牙髓组织中干细胞的比例可能高于骨髓组织。Miura发现从脱落乳牙获得的SHED每12-20个细胞即可以形成黏附克隆集落,而且与BMMSCs和DPSCs比较,SHED有着更强的增殖能力。基因表达谱显示,SHED和DPSCs有4386个基因存在两倍以上的差异,在涉及细胞增殖和细胞外基质分泌信号通路的基因方面,SHED的表达明显高于DPSCs。SHED在体外经诱导培养后可分化为成骨细胞,形成三维编织骨样结构；而在体内则不同,Miura将SHED接种于裸鼠体内,SHED不直接分化为成骨细胞,而是诱导宿主细胞分化为成骨细胞,这与DPSCs及其他牙齿组织来源的干细胞有一定的区别。鉴于SHED可能有着更为强大的体外增殖以及多向分化潜能,并且有可能具有诱导骨再生的特性,人脱落乳牙牙髓作为潜在的间充质干细胞龛,很可能是理想的成骨细胞源库,SHED所形成的矿化组织有可能用于骨再生、骨移植及其他临床治疗。由于乳牙牙髓的组织量较小,在临床应用的准备阶段,需要在体外将细胞进行大量扩增。胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)是最常应用于细胞培养的物质,它为细胞的增殖、迁移和分化等生物学行为提供营养、生长因子和激素等生物活性物质。然而,FBS的应用由于可能涉及到伦理、科学以及安全问题,限制了其应用于临床。目前大量的研究在探索应用其他培养介质替代FBS用于干细胞的体外培养。富血小板血浆(platelet-richplasma,PRP)是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物,含有大量的血小板和少量的其他血细胞。血小板中含有丰富的生长因子,包括血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF),碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF),胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfacter,IGF),转化生长因子β(transforminggrowthfactor-b,TGF-β)和血管内皮生长因子等,这些细胞因子在细胞的各种生物学行为中都发挥着重要作用。一系列基础研究证实,PRP可以促进间充质干细胞、成骨细胞和成纤维细胞等增殖、迁移和分化,且这种作用具有浓度特异性和细胞特异性。与FBS相比,PRP可以促进人MSCs增殖,减少细胞达到融合的时间,增加细胞集落形成单位(colonyformingunit,CFU)的大小,并且可以保持其成骨、成软骨和成脂分化能力,维持免疫抑制活性。用流式细胞仪检测发现,MSCs表达高水平的PDGF、bFGF、TGF-β和IGF受体,这表明血小板中的各种生长因子可以作用于MSCs。在无血清培养基中加入TGF-β、PDGF和bFGF,MSCs可以保持长梭形存活5代,MSC的增殖能力与加10%FBS的DMEM相差无几,并且仍保持多向分化的能力。在MSCs的增殖和分化过程中,PDGF、FGF和TGF-β信号通路起着重要作用,PDGF可能是PRP促进MSCs增殖和迁移的关键因子,其通过ERK信号通路影响细胞的有丝分裂。选择性地抑制PDGF受体激酶,骨细胞的形成明显减少,并且不能形成矿化结节：同时细胞增殖速率显著降低。PRP可促进DPSCs增殖,相对于FBS而言,PRP促增殖能力更强,且不改变DPSCs的免疫表型、CFU及多向分化能力。PRP通过PI3K/AKT和MAPK信号通路促进牙髓细胞的增殖和蛋白合成。PRP处理过的DPSCs高表达成牙本质基因和成骨基因,通过上调骨桥蛋白(osteoprotein,OPG)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)促进矿化。在一定浓度范围内,DPSCs的增殖能力与PRP呈浓度依赖性,但是高浓度的PRP则抑制DPSCs的增殖。由于PRP的来源及制备方法不同,尚无法确定其促进增殖和成骨分化的最佳浓度。我们的前期研究发现,10～30%的PRP可明显提高牙髓细胞ALP活性,其中以20%浓度尤为明显；10～30%的PRP明显促进了矿化诱导10天后的牙髓细胞形成矿化结节,其中10%浓度在矿化诱导20天后牙髓细胞形成的矿化结节最大。基于以上国内外研究现状和本课题组的前期研究成果,我们提出以下工作设想：(1)通过方法学的改良,在保持有效生长因子浓度的前提下,使PRP的制备和激活方式更加简便高效,更易于进行标准化,更利于提高科研的重复性和临床的可靠性；(2)一定浓度的改良富血小板血浆(modifiedplatelet-richplasma,mPRP)可以在体外更好地促进SHED的体外增殖,mPRP可以替代FBS成为组织工程骨所需干细胞体外快速扩增的培养基质；(3)在成骨诱导的条件下,mPRP有可能促进SHED在体外向成骨方向分化,从而提高组织工程骨的构建效率。为验证以上设想,本课题通过制备mPRP,并应用不同浓度的mPRP对SHED进行体外扩增培养以及成骨诱导分化。本论文主要包括以下四章内容：第一章：乳牙牙髓干细胞的分离培养和鉴定用酶消化法分离培养乳牙牙髓干细胞。经HE染色,见细胞多数呈长梭形,成纤维细胞样,少数呈多角形或卵圆形；利用CCK-8法检测细胞增殖能力,绘制细胞生长曲线显示,随培养时间延长,细胞数量增加,在第3至4天进入快速增长期,第6天进入增殖平台期,其生长特性符合干细胞增殖的一般特征；免疫细胞化学技术染色结果显示角蛋白阴性,波形蛋白阳性,说明细胞来源于间充质而非表皮；通过流式细胞术检测细胞表面标记物,有99.69%的细胞CD44阳性,90.13%的细胞CD105阳性,抗体CD34为阴性,说明细胞仅表达间充质干细胞特异性表面标记物,而不表达造血干细胞特异性表面标记物；将细胞在矿化诱导培养基中连续培养30天,茜素红染色后发现有大量的矿化结节形成,表明SHED具有向成骨细胞方向分化的能力；将细胞在成脂诱导培养基中连续培养21天,油红-O染色后可见透明高亮度点,表明SHED具有向脂肪细胞方向分化的能力。本实验获取的SHED增殖能力强,表达间充质干细胞特异性表面标记物,在不同诱导条件下可向成骨细胞和脂肪细胞等方向分化,是后续实验良好的体外细胞模型。第二章：改良富血小板血浆的制备与激活收集4份经检验合格的人AB型机采血小板,加入肝素,混匀后进行血小板计数,3×103r/min离心20mmin,吸弃部分上清,将血小板浓度调至约1×1012个/L,吸管反复吹打使血小板重新悬浮制备成为PRP；将PRP分装入冻存管内,浸入液氮罐5分钟,迅速取出浸入37℃水浴箱5分钟,反复三次,使血小板充分冻融裂解；3×103r/min离心20分钟,去除血小板沉渣,0.2μm过滤。应用酶联免疫吸附试验法定量检测富血小板血浆中PDGF-AA和TGF-β1的质量浓度,PDGF-AA的浓度为19.159μg/L,TGF-β1的浓度为57.163μg/L,与其他研究者制备所得的PRP中主要生长因子的浓度相当。第三章：改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞增殖作用研究将第4代SHED按不同培养条件分为4个实验组和1个对照组,实验组在a-MEM培养基中分别加入2%,5%,10%和20%mPRP;对照组在a-MEM培养基中加入10%FBS。以1×104/mL,200μL/孔接种于96孔板,每组4个复孔,在培养的第1至7天,CCK-8法测定孵育2小时后于450nm波长处OD值,绘制细胞生长曲线。采用SPSS18.0软件进行统计学分析。结果表明,不同浓度的mPRP均可以促进SHED的增殖,且不同浓度的mPRP促进SHED增殖的作用不尽相同,其中以2%的mPRP促增殖能力最强。在整个细胞培养周期,2%mPRP与10%FBS促增殖作用无统计学差异；5%mPRP在培养的中后期,对SHED的促增殖作用与对照组无统计学差异,而高浓度的mPRP对SHED的促增殖作用反而较弱。mPRP有可能替代FBS用于SHED的体外扩增。第四章：改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞成骨分化作用研究将生长状态良好的第4代SHED按不同培养条件分为4个实验组和1个对照组,实验组在a-MEM培养基中分别加入1%,2%,5%和10%nPRP;对照组在a-MEM培养基中加入10%FBS。各组均加入矿化诱导液进行诱导矿化。培养2、4、6天后,按照碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)试剂盒说明操作,520nm处酶标仪测各孔吸光度(OD)值,检测细胞ALP活性。结果显示,不同浓度mPRP均可增强SHED碱性磷酸酶活性,尤其是在第6天的时候,各实验组与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05),其中浓度为2%mPRP对SHED碱性磷酸酶活性的促进作用最大(P<0.01)。矿化诱导7天后,qRT-PCR检测RUNX2和骨钙素(osteocalcin,OCN)的mRNA含量,比较各组间SHED的RUNX2和OCNmRNA表达的差异。结果显示,mPRP对SHED内RUNX2和OCNmRNA表达促进作用具有浓度特异性,矿化诱导第7天时,2%mPRP组RUNX2和OCNmRNA表达量显著高于对照组,10%mPRP组OCNmRNA表达量与对照组无显著性差异,而10%mPRP组RUNX2mRNA表达量反而显著低于对照组。综上所述,本课题通过对PRP的制备和激活方法进行改良,在保证有效生长因子的浓度下,使mPRP的性状更易标准化；用不同浓度的mPRP对SHED分别进行体外扩增和成骨诱导,发现一定浓度的mPRP对SHED的增殖和骨向分化均具有一定的促进作用。选择具有更强体外增殖和成骨能力的SHED,并采用同体来源的mPRP进行体外培养,有可能解决目前制约体外组织工程骨构建中所存在的难题,从而提高组织工程骨体外构建的效率,降低成本,并增加临床治疗的安全性。本实验结果为mPRP和SHED更好地应用于骨组织工程提供了一定的实验依据。
【作者】文军；
【导师】吴补领；段建民；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】富血小板血浆；乳牙牙髓干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎牛血清；血小板源性生长因子；

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