PAP-腺苷通过激活A2B腺苷受体调节胶质瘤干细胞功能的研究

【摘要】胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,其占原发性脑肿瘤的35.26-60.96%(平均44.69%)。该肿瘤发展快,且呈浸润性生长,手术难于完全切除；同时,该肿瘤还具有对放疗和化疗耐受的特点,这些因素导致胶质瘤治疗后易复发,极大地威胁着患者的生命。尽管神经外科手术技术和放化疗技术都不断提高,但并没能显著改善脑胶质瘤患者的预后(平均生存期仅为12.6个月)。传统观点认为,胶质瘤细胞均具有无限增殖能力,但近年来研究发现,肿瘤中仅有小部分细胞具自我更新、无限增殖、多向分化潜能及致瘤的特性,这部分细胞被称为肿瘤干细胞(cancerstemcells,CSC),而其它大部分肿瘤细胞则仅具备短暂的增殖能力。到目前为止,人们已成功从消化系统肿瘤、造血系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、脑肿瘤、乳腺癌肿瘤、皮肤肿瘤等肿瘤中分离出了各自的肿瘤干细胞。研究者将脑胶质瘤中的肿瘤干细胞称之为胶质瘤干细胞(Gliomastemcells,GSCs)。胶质瘤是异质化的肿瘤,即胶质瘤中肿瘤细胞存在等级效应,不同等级的细胞在分化程度、侵袭能力、增殖能力、对化疗或放疗的敏感性等方面均有所不同。经过手术、化疗、放疗等治疗后,绝大多数胶质瘤细胞被杀死,而胶质瘤干细胞因高表达多种抗凋亡基因和耐药基因而得以残留,为胶质瘤复发的提供可能。因此,多数学者认为胶质瘤干细胞可能是胶质瘤起始、复发、转移和放化疗抵抗的根本原因。基于以上观点,探究胶质瘤干细胞生存和增殖的分子机制,寻求抑制胶质瘤干细胞生存和恶性增殖的靶点,对胶质瘤的根除性治疗极为重要。缺氧是胶质瘤细胞生存微环境中最常见的特征,胶质瘤临床标本中经常可见严重缺氧导致的肿瘤性坏死。然而,胶质瘤干细胞却能耐受这种肿瘤性缺氧；同时,缺氧能阻断肿瘤干细胞分化并且促进其增殖。因此,对胶质瘤干细胞增殖的研究应当在缺氧的环境中进行。研究发现,在缺氧应激下,普通肿瘤细胞功能紊乱,ATP和AMP等分子会被释放到细胞外。这些分子在细胞外具有抗肿瘤效应,能抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞发生凋亡。然而,外核苷酶能将胞外ATP和AMP分子水解并生成腺苷；胞外的腺苷是一种组织保护因子,能促进血管生成、减少放疗损伤和缺血再灌注损伤。胶质瘤临床组织微环境的研究发现,胶质瘤干细胞生存的缺氧微环境中腺苷浓度比肿瘤周边区高出100倍以上。因此,胶质瘤干细胞可能表达一种外核苷酶,将胞外不利的ATP和AMP分子转化为有利的腺苷分子,借此在肿瘤性缺氧微环境中生存和增殖。CD73和前列腺酸性磷酸酶(prostaticacidphosphatase,PAP)是目前发现的两种外核苷酶。CD73表达在黑色素瘤、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤细胞中,其通过产生腺苷对肿瘤细胞的增殖具有促进作用；然而,CD73在肿瘤干细胞中表达情况尚未见报道。PAP最早被发现在前列腺组织中表达,然而其功能不详。近年,研究发现PAP表达在脊髓背根疼痛性神经元中,其具有外核苷酶活性能生成腺苷刺激下游通路缓解疼痛；然而,PAP在肿瘤干细胞中表达情况也未见报道。本研究小组在前期实验中发现PAP高表达于缺氧的胶质瘤干细胞中。本实验拟探究PAP在脑胶质瘤干细胞中的表达模式,探讨其在脑胶质瘤干细胞的作用及作用机制,为胶质瘤的治疗提供新的思路。第一部分胶质瘤干细胞系的构建目的：利用改良的功能性纯化方法从原代胶质母细胞瘤组织细胞、胶质母细胞瘤细胞系细胞中培养、纯化胶质瘤干细胞,并建立肿瘤干细胞细胞系。方法：选择人原代胶质母细胞瘤组织细胞GL1和人胶质母细胞瘤细胞系细胞U87,应用无血清干细胞培养基(stemcellmedium,SCM.内含DMEM/F12+40ng/mLbFGF+40ng/mLEGF+4%B27)培养,通过缺氧下地细胞浓度悬浮肿瘤球培养并连续传代的功能性纯化方法,从人原代胶质母细胞瘤组织细胞GLl和人胶质母细胞瘤细胞系细胞U87中培养、纯化,获得第五代肿瘤球；对第五代肿瘤球细胞的一般形态、细胞活性、干性标记物、自我更新能力、多向分化能力进行观察鉴定,构建胶质瘤干细胞系。结果：低细胞密度的U87和GL1胶质瘤细胞在缺氧下无血清干细胞培养基中有悬浮生长的肿瘤球形成；并且,这些肿瘤球还能连续传代增殖成肿瘤球。随机选择的10个第五代肿瘤球切片中,CD133阳性细胞平均占95%,Nestin阳性细胞平均占89%。第五代肿瘤球细胞在Matrigel包被培养板上显示贴壁特性,在无Matrigel包被的培养板上显示再成球特性。在含血清培养基中第五代肿瘤球细胞能迅速贴壁并从肿瘤球中爬出；爬出的细胞在无血清干细胞培养基中又能增殖成肿瘤球。添加血清后第五代肿瘤球细胞能分化为表达神经元(βⅢ-Tublin)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(01)的子代肿瘤细胞。结论：人胶质瘤细胞系U87和人胶质瘤组织GL1中存在具无限增殖、自我更新及多向分化潜能的肿瘤干细胞。利用缺氧下功能性纯化方法培养出的第五代肿瘤球细胞具有表达肿瘤干细胞标记物特性、无线增殖能力、自我更新能力和多系分化能力,符合胶质瘤干细胞的特征；此外,这些细胞还具有良好的细胞活力,并且在Matrigel包被培养板上显示贴壁特性。因此,Matrigel中贴壁生长的U87和GL1来源的第五代肿瘤球细胞可被用作胶质瘤干细胞系(分别为U87GSC和GL1GSC)。第二部分PAP的表达和缺氧对PAP的调控目的：比较缺氧或生理氧培养下的普通胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中PAP或CD73的表达情况,并探索缺氧对PAP的调控作用。方法：用Westernblot和QRT-PCR检测并比较缺氧或生理氧下U87和U87GSC中PAP和CD73蛋白及mRNA的表达情况。用Westernblot和QRT-PCR进一步比较缺氧或生理氧下人非肿瘤脑组织细胞NT1、人胶质瘤细胞系U87和人胶质瘤临床组织来源细胞GL1中PAP蛋白及mRNA的水平,同时比较缺氧或生理氧下人神经干细胞NT1NSC、细胞系来源人胶质瘤干细胞U87GSC和临床胶质瘤组织来源胶质瘤干细胞GL1GSC中PAP蛋白及mRNA的水平。用Westernblot和QRT-PCR检测并比较HIF1a、HIF2a和PAP在U87和U87GSC四个缺氧时间点(Oh,12h,24h,48h)中的表达情况,借此推断HIF1a和HIF2a两者中哪一个与PAP表达模式最密切。然后,依次干扰HIF1a或HIF2a的表达,观察胶质瘤干细胞增殖能力的变化；同时检测干扰后PAP表达量的变化,借此判断HIF1a和HIF2a两者中哪一个可能参与调节PAP的表达。结果：CD73在U87和U87GSC中表达极弱。PAP在非肿瘤脑组织细胞(NT1)、神经干细胞(NTINSC)和胶质瘤细胞(GL1及U87)中的表达极弱；而PAP在胶质瘤干细胞(GL1GSC、U87GSC)中呈中等量表达,且缺氧对其表达有促进作用(P<0.01)。Westernblot和QRT-PCR检测结果表明,在U87细胞中,随着缺氧时间的延长,HIF1a表达量在逐渐升高；而HIF2a和PAP起始表达量极低且缺氧后变化不明显；在U87GSC细胞中,HIF2a和PAP起始表达量高且随着缺氧时间的延长两者的表达量明显升高,而HIF1a表达量随着缺氧时间的延长升高不明显。肿瘤球切片的免疫组化染色实验也发现,U87GSC来源肿瘤球缺氧后PAP和HIF2a的蛋白表达量均升高。RNAi实验发现,干扰HIF1a的表达对U87GSC和GL1GSC细胞来源肿瘤球的生长并无影响；然而,干扰HIF2a的表达明显降低U87GSC和GL1GSC细胞来源肿瘤球的生长体积。此外,干扰HIF1a的表达并不影响缺氧下胶质瘤干细胞中PAP的表达,而干扰HIF2a却明显降低缺氧下胶质瘤干细胞中PAP的表达量。结论：CD73在普通胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中几乎不表达；而PAP表达在胶质瘤干细胞上,且其表达受缺氧影响。缺氧下胶质瘤干细胞中HIF2a和PAP的表达具有同向性。缺氧对胶质瘤干细胞的促增殖作用是通过HIF2a实现的。缺氧的胶质瘤干细胞中HIF2a对PAP的表达有上调作用。第三部分PAP的功能及其机制目的：探索PAP在胶质瘤干细胞上的功能及其机制方法：利用RNAi技术干扰胶质瘤干细胞中PAP的表达,并通过Westernblot实验验证干扰效果。利用高效液相质谱检测并比较U87GSC和GL1GSC细胞的AMP添加组、AMP未添加组和AMP添加同时干扰PAP表达组中细胞外液的腺苷浓度。利用肿瘤球形成实验检测U87GSC和GL1GSC细胞的PAP干扰组、PAP干扰同时添加腺苷组、腺苷添加组、对照组在缺氧下形成肿瘤球的数量和体积。利用有限稀释法检测缺氧下U87GSC和GL1GSC细胞4个细胞组细胞在96孔板中不同细胞密度下是否形成肿瘤球,并以此作图计算出各组理论上形成一个肿瘤球所需细胞数量。利用荧光标记流式细胞仪检测4个细胞组的细胞周期并通过公式SPF(S-phasecellfraction)=S/(GO/G1+S+G2/M)计算出各组细胞的增殖指数。利用裸鼠皮下成瘤法,检测U87来源胶质瘤干细胞的PAP干扰组、PAP干扰同时添加腺苷组、腺苷添加组、对照组在体内形成肿瘤情况,每5日测量肿瘤体积并依据时间点绘出肿瘤的增殖曲线。利用QRT-PCR技术检测缺氧下4类腺苷受体(A1、A2A、A2B、A3)在U87GSC和GL1GSC细胞中的表达情况,判断在胶质瘤干细胞中哪些腺苷受体可能与胶质瘤干细胞的增殖相关。在U87GSC和GL1GSC细胞中,分别干扰A2B和A3腺苷受体的表达,并用QRT-PCR技术检测干扰效果。分别将U87GSC和GL1GSC分为五个细胞组(对照组、A2B受体干扰组、A3受体干扰组、A2B受体化学阻断组、A3受体化学阻断组),分别将各组细胞用于肿瘤球形成实验,观测并记录各组形成的肿瘤球细胞数量和体积,并通过统计学比较各组间数量和体积的差异。利用Westernblot技术检测缺氧下U87GSC四个细胞组(腺苷添加组、PAP干扰同时添加腺苷组、PAP干扰组、对照组)磷酸化及非磷酸化Akt、Erk、JNK的表达情况,判断四个细胞组分别激活了哪条些通路。然后,再利用Westernblot技术检测缺氧下U87GSC五个细胞组(对照组、A2B受体干扰组、A3受体干扰组、A2B受体化学阻断组、A3受体化学阻断组)中磷酸化及非磷酸化Akt、Erk的表达情况,判断这两条通路的激活是被A3和A2B腺苷受体中的哪个刺激所引起。结果：Westernblot实验发现,干扰PAP表达后,PAP的表达量明显降低。缺氧24h后,添加AMP的U87GSC和GL1GSC细胞组中胞外腺苷的浓度明显高于相应的未添加组。此外,在添加组中干扰PAP的表达会明显降低细胞外液中腺苷浓度。在肿瘤球形成实验中,干扰PAP的表达导致U87GSC和GL1GSC细胞形成肿瘤球的数量和体积明显减少；而干扰PAP表达同时添加腺苷能明显抑制这种现象；此外,单纯添加腺苷还能明显增加形成肿瘤球的数量和体积。有限稀释法实验发现,干扰PAP的表达导致U87GSC和GL1GSC细胞理论上需要更多的数量才能形成一个肿瘤球；而干扰PAP表达同时添加腺苷能明显抑制这种现象；此外,单纯添加腺苷还能明显减少理论上形成一个肿瘤球所需的细胞数量。细胞周期检测发现,干扰PAP的表达导致U87GSC和GL1GSC细胞的增殖指数(theS-phasecellfraction,SPF)显著下降,而同时添加腺苷却能抑制这一现象；单纯添加腺苷能明显升高细胞增殖指数。裸鼠成瘤实验表明,干扰PAP的表达明显抑制U87GSC来源胶质瘤的生长速度,而腺苷的添加则显著提高该肿瘤的生长速度。QRT-PCR实验发现,缺氧下U87GSC和GL1GSC细胞表达A2B和A3腺苷受体,而不表达A1和A2A腺苷受体。干扰A2B和A3腺苷受体后,两者的表达量显著降低。A3腺苷受体表达的干扰或化学阻断均不能影响U87GSC和GL1GSC细胞来源肿瘤球的成球率(肿瘤球数量数量)和生长速度(肿瘤球体积)。然而,A2B腺苷受体表达的干扰或化学阻断均导致U87GSC和GL1GSC细胞来源肿瘤球的生长速度明显减慢,成球率也明显降低。干扰PAP的表达或添加腺苷对JNK的磷酸化没有影响。干扰PAP的表达使Akt和Erk-1/2的磷酸化水平显著降低；而单纯添加腺苷则使Akt和Erk-1/2磷酸化水平显著升高。A3腺苷受体表达的干扰或化学阻断均不影响U87GSC中Akt和Erk-1/2的磷酸化水平。然而,A2B腺苷受体表达的干扰或化学阻断却均能导致U87GSC细胞中Akt和Erk-1/2的磷酸化水平明显降低。结论：PAP具有外核苷酶活性,能将胞外AMP转化为胞外腺苷。体内实验表明,PAP通过生成腺苷能促进胶质瘤干细胞增殖并形成肿瘤球；外实验表明,PAP通过生成腺苷对胶质瘤干细胞动物成瘤有促进作用。PAP-腺苷的促增殖功能可能是通过刺激A2B腺苷受体,并激活Akt和Erk-1/2通路实现的。
【作者】刘天助；
【导师】张世忠；郭洪波；
【作者基本信息】南方医科大学，神经外科，2014，博士
【关键词】前列腺酸性磷酸酶；腺苷；A2B受体；胶质瘤干细胞；

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