染色体15q25.1区域基因多态性与中国南方人群肺腺癌易感性的关联研究

【摘要】研究背景和目的：肺癌是严重威胁人类健康和生命的疾病,在我国及大多数工业化国家,肺癌已位居全部恶性肿瘤死因的首位,并且其发病率和死亡率目前仍在继续上升。肺癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果,尽管其发病机制至今尚未完全阐明,但流行病学资料显示,吸烟者罹患肺癌的风险是非吸烟者的20倍,由此可见吸烟是与肺癌发病风险关系最为密切的环境危险因素。但是,尽管80%以上的肺癌与烟草依赖或成瘾行为有关,吸烟者中却仅有10%-15%会发生肺癌。这表明个体对肺癌的易感性存在差异,而导致这种差异的原因来自于遗传多态性。全基因组关联研究(Genome-wideassociationstudies,GWAS)是研究肺癌等复杂性疾病遗传易感性的有效手段。近年来,人类基因组计划以及国际基因组单体型图谱计划的实施和推进,加之基因分型检测系统的不断发展和完善,为GWAS奠定了基础。GWAS的基本原理如下：首先在研究目标人群中设立病例组和对照组,应用单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)作为遗传标记物,在两组间进行全基因组范围的对照分析。如果相比对照组,病例组中某个SNP位点的等位基因或基因型出现的频率具有显著差异,则该位点可能与疾病的发病风险相关。然后研究者通过基因定位以及连锁不平衡分析来判断可能的疾病易感基因。目前在世界范围进行的GWAS已经筛选出一批与肺癌遗传易感性相关的常见基因变异,例如在染色体5p15、6p21和15q25区域发现了多个与调控端粒酶生成和乙酰胆碱尼古丁受体功能相关的基因变异位点,这些位点的遗传多态性可增加或降低个体罹患肺癌的风险。以上研究结果提示通过检测与罹患肺癌风险相关的遗传学分子标志,有助于进行肺癌病因学研究及筛选肺癌高危人群。SNP即单核苷酸多态性,指的是基因组DNA链上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNP在人类基因组中的数量众多,其可能发生在基因的编码序列或非编码序列上。根据SNP在基因中位置的不同,可分为基因调控区SNP(RegulatorySNP,rSNP)和基因编码区SNP(CodingSNP,cSNP)。其中,cSNP根据是否影响氨基酸序列和蛋白质功能又可分为同义cSNP(SynonymouscSNP)和非同义cSNP(Non-synonymouscSNP)。同义cSNP指碱基序列的改变并不引起蛋白质的氨基酸序列变化；而非同义cSNP位于蛋白编码开放阅读框内,其变异可改变编码的氨基酸残基的种类,从而使蛋白质的结构和功能发生变化。此外,出现在调控区的rSNP则可以通过影响与转录因子或miRNA的结合,引起基因表达水平的改变或mRNA的稳定性及翻译过程的变化,进而影响细胞正常功能。因此,这些潜在功能性SNP通常被优先选择用于探讨与疾病发生发展及预后的关系,从而为包括肺癌在内的恶性肿瘤的防治及临床治疗决策提供科学依据。SNP与肺癌易感性关系的研究目前已成为肺癌研究领域的热点,并且在世界多个地区进行的GWAS已经寻找到一些影响肺癌发病风险的易感基因位点和染色体区域。例如,位于染色体15q24-25区域的尼古丁基因家族成员CHRNA3-CHRNA5-CHRNB4(cholinergicreceptor,nicotinic,α3,α5andβ4)可编码烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinicacetylcholinereceptors,nAChRs),与个体的吸烟行为有关。2008年以来,冰岛、法国和英国等多个研究团队通过GWAS发现该基因簇上的SNPs变化能显著影响肺癌的发病风险,该结果表明遗传因素在肺癌发病中的作用不容忽视。Amos等在美国1154名吸烟的非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者和1137名吸烟状态匹配的健康人群中进行315450个SNPs检测,结果显示与肺癌发病关系最密切的SNPs位点有10个,分别为rs2808630、rs7626795、rs2202507、rs11099666、rs1481847、s855974、rs8034191、rs1051730、rs12956651以及rs6069045。之后,进一步的研究发现在不同种族人群中SNP的分布有所不同。例如,欧洲的GWAS显示位于染色体15q25.1区域的SNP位点rs8034191、rs1051730和rs16969968与肺癌的发病风险显著相关。然而,在韩国、日本及中国人群中的研究却未能重复该实验结果,其原因可能是因为这些多态位点的最小等位基因频率在亚洲人群中的分布较低所致：MAF(MinorAlleleFrequency)分别为0.022,0.026,0.026。以上研究提示肺癌的易感基因位点分布存在种族和地域的差异。因此,有必要在我国人群中进行基因多态性与肺癌发病关联的研究,寻找中国人群的肺癌易感位点,为我国肺癌高危人群的筛查以及个体化预防和治疗奠定数据基础和理论依据。位于染色体15q25.1区域的基因包括AGPHD1(aminoglycosidephosphotransferasedomaincontaining1),CHRNA5和CHRNA3(cholinergicreceptornicotinicα5and3)。该基因簇位于大脑核心区域的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)可能影响个体的吸烟行为及烟草成瘾；另外位于肺支气管上皮细胞的受体则参与调控烟草致癌物的信号转导通路,通过抑制细胞凋亡及促进肿瘤增殖,与肺癌的发生关系密切。尽管在欧美及亚洲人群中均报道了该基因家族的变异位点与肺癌的发病风险关联,但产生该关联的机制是通过影响吸烟行为还是直接作用于癌变的分子通路,或是二者的协同作用,目前尚无定论。基于部分研究结果表明尼古丁受体基因家族的变异位点能促使个体的吸烟量增加,故研究人员认为基因多态性通过影响吸烟行为而提高机体罹患肺癌的风险。例如冰岛的GWAS结果发现染色体15q24-25区域上rs1051730位点的遗传变异与烟草成瘾行为有关,可导致个体的吸烟量及罹患肺癌的风险增加。rs1051730位点上T/T基因型多态性不仅使机体每日吸烟量增加9.5%,并且其携带者罹患肺癌的风险为杂合型的1.31倍。因此研究者认为SNP位点的变化和吸烟行为对增加肺癌的发病风险具有协同作用。然而,法国和美国学者进行的GWAS却得出了不同的结论,其研究结果表明染色体15q25区域rs1051730和rs8034191位点的多态性变化与吸烟量及尼古丁依赖均无关。并且研究发现rs8034191和rsl6969968位点上的SNP变化只是影响肺癌的发病风险,而对于其它烟草相关的肿瘤如口腔癌、食道癌、喉癌等,并没有相关性。因此研究者认为染色体15q25区域的SNPs变化与肺癌发病风险直接相关,并不依赖于吸烟行为。由于以上研究结果的不一致性,因此有必要在不同种族及不同吸烟状态的人群中对基因多态性与肺癌发病的关联进行验证,并且探讨可能影响易感基因功能的其他环境和遗传危险因素。肺癌按照病理类型可分为小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)与非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC),NSCLC中最常见的类型为鳞状细胞癌和腺癌。目前肺腺癌的发病率在全球范围呈不断上升趋势,其具体原因尚不明确,研究认为可能与被动吸烟、环境污染、饮食习惯、激素水平以及基因易感性等有关。肺腺癌在女性非吸烟患者中多见,已有研究表明女性非吸烟肺腺癌具有特殊的基因表型如EGFR突变、EML4-ALK重排等。以上研究提示女性非吸烟肺腺癌的发生机制可能在与吸烟者肺癌重叠的同时,还有其独特的分子通路。2011年国际肺癌研究协会(InternationalAssociationfortheStudyofLungCancer,IASLC)/美国胸科学会(AmericanThoracicSociety,ATS)／欧洲呼吸学会(EuropeanRespiratorySociety,ERS)颁布的肺腺癌国际多学科分类新标准中将肺腺癌分为原位腺癌、微小浸润性腺癌及浸润性腺癌。该分类不仅定义了肺腺癌组织学的发展谱系,而且更加关注肿瘤在进展过程中的基因或分子表型特征。那么,在肺腺癌的发生、发展谱系中是否也存在SNPs分布的差异?目前,虽然肺癌的易感基因研究已取得很大进展,但大部分数据是以西方人群为基础,有关中国汉族人群的研究数据仍十分缺乏。此外,由于肺腺癌不断升高的发病率以及独特的分子表型,针对中国人群肺腺癌的病因学研究尤为重要。本课题旨在通过病例-对照分析,探讨染色体15q25.1区域基因多态性与中国南方人群肺腺癌发病的相关性,从而为肺腺癌高危人群的筛查、早期诊断和个体化治疗提供理论依据和数据基础。实验将研究对象限定在中国广东汉族人群肺腺癌患者,并且按照肺腺癌国际多学科分类将病例重新进行病理分型。选取6个位于染色体15q25.1区域的可能肺腺癌易感SNP位点,利用SequenomMassARRAY(?)-IPLEX检测平台在中国南方肺腺癌患者和健康对照者中进行基因分型,一方面统计分析各个位点的多态性分布及与肺腺癌易感性的关系,验证适合中国广东人群的肺腺癌易感SNP位点；另一方面对各位点多态性与肺腺癌患者的性别、吸烟状态、病理类型及TNM临床分期的相关性进行分层分析,探讨基因型分布与临床病理因子之间的关系；同时利用免疫组化方法检测阳性位点基因的蛋白在肺腺癌组织中表达水平,进一步验证该基因在肺腺癌发生中的作用。综合以上数据为中国南方人群肺腺癌高危人群的确定及个体化预防和治疗奠定初步的数据基础和理论依据,也为下一步建立适合中国南方人群的肺腺癌易感基因风险评估模型做准备。研究方法：1.研究对象病例组为2011年9月-2012年9月广州医科大学附属第一医院胸外科经病理证实为肺腺癌患者301例；对照组为同期来自体检中心的健康人群318例。研究对象均来源于广东地区汉族人群,采集所有研究对象外周血样本。2.SNP位点的挑选从NCBI的SNP信息数据库、全基因组关联分析以及其它国内外大样本研究得到的阳性位点中挑选出6个位于染色体15q25.1区域的可能肺腺癌易感SNP位点：位于AGPHD1基因的rs8034191；位于CHRNA5基因的rs16969968以及位于CHRNA3基因的rs1051730、rs938682、rs12914385和rs8042374。3.基因分型与数据分析利用SequenomMassARRAY(?)-IPLEX检测平台在中国南方肺腺癌患者和健康对照者中进行基因多态性分型,整理检测结果并利用SPSS13.0软件进行相关统计分析。分别在共显性模型(Codominantmodel)、显性模型(Dominantmodel)、隐性模型(Recessivemodel)、超显性模型(Overdominantmodel)和附加模型(Log-additivemodel)五种遗传模型中探讨各个位点的多态性分布与肺腺癌患病风险的关系,验证中国南方人群肺腺癌易感SNP位点。4.对各位点多态性与肺腺癌患者的性别、吸烟状态、病理类型及TNM临床分期的相关性进行分层分析,探讨基因型分布与临床病理因子之间的关系。5.利用免疫组化方法检测阳性位点基因的蛋白在肺腺癌组织中表达水平。结果：第一部分基因多态性与肺腺癌发生的关系本研究选取了位于染色体15q25.1区域上的6个SNPs位点,在301例广东肺腺癌患者和318例健康对照人群中进行了基因分型和统计分析。结果显示,除rs12914385外,其它5个位点的基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),病例对照分析发现2个与肺腺癌发病风险相关的多态性位点。位于CHRNA3基因的位点rs8042374,符合共显性和超显性模型,与G/G及A/A基因型相比,G/A基因型携带者的患病风险升高,OR值(95%CI)分别为1.76(1.17-2.65),P=0.024和1.71(1.15-2.54),P=0.008。另外一个位于CHRNA3基因的位点rs938682,符合显性模型,与T/T基因型相比,携带T/C或C/C基因型可能降低个体的患病风险,OR值(95%CI)为0.68(0.45-1.02),P=0.063。其他三个SNP位点(rs8034191、rs16969968和rs1051730)未显示多态性。分层分析显示,rs8042374的G/A基因型与女性、非吸烟、TNM分期Ⅰ+Ⅱ、女性非吸烟以及女性TNM分期Ⅰ+Ⅱ显著相关,OR值(95%CI)分别为1.79(1.04-3.07)；1.80(1.18-2.75)；1.81(1.14-2.87)；1.81(1.05-3.12)和1.92(1.03-3.57)。此外,rs938682的T/C或C/C基因型对吸烟者、TNM分期Ⅲ+Ⅳ以及男性TNM分期Ⅲ+Ⅳ者具有保护作用,可降低个体的患病风险,OR值(95%CI)分别0.50(0.26-0.97)；0.54(0.33-0.89)和0.40(0.20-0.82)。第二部分CHRNA3蛋白在肺腺癌组织中的表达基于本研究的两个阳性SNP位点均位于CHRNA3基因,我们进一步利用免疫组化技术在81例肺腺癌及癌旁肺组织中检测CHRNA3蛋白的表达。结果显不CHRNA3蛋白在肺腺癌及癌旁肺组织中均有表达,正常肺组织中的肺泡及支气管上皮均显示不同程度的阳性染色,而在肿瘤组织中,阳性染色仅表达于腺癌细胞,在肿瘤间质细胞不表达。WilcoxonSignedRanksTest统计结果显示CHRNA3蛋白在肺腺癌组织与癌旁正常肺组织中的表达具有显著差异(Z=3.357,P=0.001)。但是SNP基因型与蛋白表达未显示相关性。结论：1.本研究结果显示位于染色体15q25.1区域的2个SNP位点与中国南方人群肺腺癌患病风险相关。其中rs8042374位点G/A基因型携带者的患病风险升高；而rs938682位点T/C或C/C基因型可能降低个体的患病风险。2.对肺腺癌病例组分层分析结果显示,rs8042374的G/A基因型与女性、非吸烟、TNM分期Ⅰ+Ⅱ、女性非吸烟以及女性TNM分期Ⅰ+Ⅱ显著相关,提示rs8042374的G/A基因型与肺腺癌发病风险的关系与吸烟行为无关；反之,rs938682的T/C或C/C基因型对吸烟者、TNM分期Ⅲ+Ⅳ以及男性TNM分期Ⅲ+Ⅳ者具有保护作用。3.CHRNA3蛋白在肺腺癌组织及癌旁正常肺组织中的表达具有显著差异,提示该基因的转录产物可能参与了肺腺癌的发生。
【作者】何萍；
【导师】何建行；
【作者基本信息】南方医科大学，胸心外科学，2014，博士
【关键词】肺腺癌；单核苷酸多态性(SNP)；染色体15q25.1；CHRNA3；

【参考文献】
[1]李慧.基于MWorks的螺杆压缩机型线的研究与仿真[D].华中科技大学,制冷及低温工程,2013,硕士.
[2]周洪江.海上旅客运输强制责任保险制度研究[D].外交学院,国际法,2014,硕士.
[3]王伟伟.脐血CIK细胞对非霍奇金淋巴瘤的体外杀伤作用及机制的研究[D].河北医科大学,儿科学,2013,硕士.
[4]赵悦.吉林省小学数学家庭作业布置与批改情况的调查研究[D].东北师范大学,教育（专业学位）,2012,硕士.
[5]刘非.我国古代中央与地方关系的研究[D].中共北京市委党校,行政管理,2013,硕士.
[6]邓卫兵.涉外工程项目的风险管理[D].大连理工大学,工程管理（专业学位）,2013,硕士.
[7]吴超.2011亚洲U-16女足锦标赛中、日、朝主要技战术对比研究[D].北京体育大学,竞赛组织,2013,硕士.
[8]赵清松.风电场电压无功协调控制及低电压穿越研究[D].沈阳工业大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[9]蒋学清,丁研.现代教育技术下的新型大学英语教学模式理论框架初探[J].外语电化教学,2012,06:42-46.
[10]刘伟.全压式液化石油气船舶液货系统的仿真研究[D].大连海事大学,轮机工程,2004,硕士.
[11]肖晗.商业银行商业模式创新：以微型金融为例[D].复旦大学,财务管理,2012,硕士.
[12]杨宝学.主动式网络管理系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[13]孙钢.基于.NET平台的服务质量管理研究[D].广西大学,企业管理,2004,硕士.
[14]王丽华.大连北三市发展生态农业的潜力、途径与对策研究[D].辽宁师范大学,人文地理,2003,硕士.
[15]胥通奇.钢筋混凝土结构强度中心运动与结构扭转的相关性研究[D].内蒙古科技大学,防灾减灾工程及防护工程,2013,硕士.
[16]吕刚.两种预处理方法处理源分离尿液的实验研究[D].哈尔滨工业大学,环境工程,2014,硕士.
[17]赵杰辉.电力市场营销分析理论研究及决策支持系统开发[D].天津大学,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[18]史伟.西安市城市生态环境建设及可持续发展研究[D].成都理工大学,科学技术哲学,2013,硕士.
[19]喻楠.项目评级工具在财政支出绩效评价中的应用研究[D].复旦大学,行政管理,2012,硕士.
[20]刘慧超.中国传统庭院空间形态在现代居住区景观设计中的应用[D].大连工业大学,设计艺术学,2011,硕士.
[21]白梨花.放牧对羊草草甸草原菌根共生及菌根效应的影响[D].内蒙古农业大学,植物营养学,2013,硕士.
[22]张宇石,陈旭梅,于雷,何波,林国鑫.基于换乘站点的轨道交通与常规公交运营协调模型研究[J].铁道学报,2009,03:11-19.
[23]梁玉朋.基于学习者需求的高职院校英语教材评估[D].华中师范大学,学科教学,2013,硕士.
[24]韩巧焕.蜂窝网络中的资源分配和小区间干扰协调[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[25]党辉.新疆广告产业发展研究[D].新疆大学,新闻传播,2013,硕士.
[26]赵若曦.性别变形：从自我解构角度解读《新夏娃的激情》中的畸形人[D].山东大学,英语语言文学,2013,硕士.
[27]李丹.应用ARMS对成都及周边地区15个β地中海贫血家系进行基因分析[D].四川大学,儿科学,2003,硕士.
[28]张晓磊.水库移民政策历史演进研究[D].中国地质大学（北京）,公共管理,2014,硕士.
[29]李金诚.激电中梯方法在海南乙通铜钼矿勘查中的应用研究[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2013,硕士.
[30]郑钟云.近代中朝贸易述论（1840-1910）[D].东北师范大学,中国近现代史,2012,硕士.
[31]闵雷.湖北监利程集古镇研究[D].武汉理工大学,2005.
[32]王金全.一种多租户数据管理方法及其在智能交通中的应用[D].北方工业大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[33]付海敏.宋代私有田宅交易纠纷及其处理[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[34]鲍峥.对当代油画中的“笔触语言”的研究[D].河北师范大学,美术学,2012,硕士.
[35]朱脉勇.过渡金属铁、铜氧化物纳米材料的制备及催化应用研究[D].扬州大学,2011.
[36]段春巧.转录因子Bcl-6/Blimp-1在原发性干燥综合征中的致病作用[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[37]白威峰.延胡索及其有效成分抗吗啡成瘾多巴胺系统作用机制研究和效果比较[D].遵义医学院,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[38]王尧.吉登斯“第三条道路”理论及其实践价值探析[D].吉林大学,国外马克思主义研究,2013,硕士.
[39]常永娜.有氧运动和葡甘聚糖对大鼠肝脏胰岛素抵抗形成中抵抗素及AMPK的影响[D].扬州大学,运动人体科学,2011,硕士.
[40]阳勋.成都彭州国税震灾后发展振兴战略执行调查研究[D].电子科技大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[41]董祥军,宋瀚涛,姜合,陆玉昌.时态关联规则的研究[J].计算机工程,2005,15:24-26.
[42]兰天瑶.《三四郎》中人物细节描写的汉译比较[D].吉林大学,翻译,2014,硕士.
[43]张伟.教学评估系统中组件重用的研究[D].河北大学,计算机应用技术,2002,硕士.
[44]文龙.功能化杯芳烃修饰仿生纳米通道的构建及其性能研究[D].华中师范大学,有机化学,2013,硕士.
[45]范英杰.脉冲激光对金属薄膜退火的缺陷诱导效应建模和数值分析[D].武汉理工大学,应用数学,2012,硕士.
[46]严雪丹.“自然人本”下的万泉河流域植被景观恢复性规划[D].中南林业科技大学,园林植物与观赏园艺,2013,硕士.
[47]吴伟.绍兴市中心镇建设与城乡经济社会协调发展研究[D].浙江大学,农业推广（专业学位）,2009,硕士.
[48]王文庆,杨远玲,杨春杰.一种基于证据理论的数据融合算法[J].控制与决策,2013,09:1427-1430.
[49]侯保俭.长江上游流域统计降尺度方法研究[D].重庆交通大学,水文学及水资源,2012,硕士.
[50]许世杰.创业者领导风格与冲突及新创企业绩效的关系研究[D].哈尔滨工业大学,企业管理,2013,硕士.