单核苷酸多态性与广州汉族人群前列腺癌的相关性研究

【摘要】研究背景：前列腺癌是影响男性健康的最常见恶性肿瘤之一,多发生于60岁以上的老年男性,2002年全球新发病例为679000例,居于男性肿瘤的第二位。前列腺癌的发病率因地域及种族的差异而不同。前列腺癌发病率最高的地区是北美和斯堪的纳维亚半岛,而大部分亚洲国家为低发病率地区。美国黑人前列腺癌的发病率最高,达到185.7/10万,美国高加索人(白种人)107.8/10万,其它西方发达国家的发病率为50～103/10万。在欧洲国家,每年大约有190000新发病例,并且大约有80000例患者死于前列腺癌。亚洲国家中,中国和日本发病率低于其他国家,日本发病率为9/10万,中国发病率为2.3/10万(上海地区为7.7/10万)。无论是前列腺癌的高发地区还是低发地区,从1973年到1992年前列腺癌的发病人数都在逐年增加。因此研究前列腺癌发生发展的相关因素以及早期预防前列腺癌的发生是当务之急。目前对前列腺癌的病因尚不完全清楚,年龄、种族、家族史是目前已知的危险因素。不同种族和地区间发病率的差异可能与遗传背景、环境及生活方式等多方面因素有关。有研究已证实遗传易感和环境因素都会对前列腺癌的发生造成影响,其中遗传易感的重要物质基础之一就是单核苷酸点突变所造成的单核苷酸多态性。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms,SNPs)是在基因组水平由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。其中发生率小于1%的变异称为突变,大于1%的则称为单核苷酸多态性。SNPs在人类基因组中广泛存在,是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP,SNPs总量大约为3×106个。由于SNPs仅涉及单个碱基的变异,故可以由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起,也可由碱基的插入或缺失造成。通常所说的SNPs是指转换和颠换。大部分SNPs是无意义的,不影响蛋白功能或者基因表达(如非编码区SNPs)。一般根据SNPs在基因组中的位置以及是否引起基因编码的改变,可将SNPs分为几类：约95%的SNPs位于非编码区,其中一小部分位于基因调控区,称为基因调控区SNPs(regulatorySNPs,rSNPs)；而位于基因编码区的SNPs称为编码SNPs(codingSNPs,cSNPs)。若cSNPs不改变所编码的氨基酸序列则称为同义SNPs(synonymousSNPs,sSNPs),导致氨基酸序列改变则称为非同义SNPs或错义SNPs(non-synonymousSNPs,nsSNPs)。SNPs能通过多种途径影响基因的功能,有一部分已被证明SNPs和前列腺癌发生、发展及预后密切相关。由于SNPs在人群中分布广泛,并且这种遗传标记相对稳定,能从个体出生到死亡一直存在,使遗传分析能在发病前几十年进行开展。因此,SNPs不但能提供和证明肿瘤发生的遗传性病因,也为常见肿瘤普查提供了一种有效的检测手段。SNPs作为第三代遗传标记,只有两种等位型,变异程度不如微卫星,但由于在基因组中总数量巨大,分布频密,具有较微卫星更稳定的遗传特性。在基因组筛查SNPs过程中一般只需阳性或阴性(+/-)分析,故易于分型检测并实现分析的自动化。相比第一、二代遗传标记更有适合对复杂疾病遗传的解析和基于群体基因识别等方面的研究,并已取代微卫星标记技术进入基因研究应用的领域。采用SNPs进行分析有助于解释不同个体之间的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病易感性、药物耐受性以及对环境因素的反应差异,目前已广泛应用于分子诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面。常见的SNPs的分析方法分为三类,第一类为基于遗传流行病学的关联分析,是通过研究SNPs在疾病易感性、药物反应性及其他相关遗传表型差异的方法；第二类为细胞和生化水平的分析,通过分析酶活力、细胞信号通路等方面来阐述SNPs对基因功能方面的影响；第三类为基于SNPs影响基因表达的分子机制研究,通过对SNPs在基因转录、翻译及蛋白表达的作用进行分析,探讨SNPs影响基因功能的机制。2008年ZhengSL等在新英格兰医学杂志上发表的文章中提到,在五个前列腺癌高风险位点中(三个位于8q24,另两个分别位于17q12和17q24.3)各选择一个危险比最高的SNP进行联合分析,这五个SNPs各自的前列腺癌患病风险比值比(OR)在1.22到1.53之间,然而当基因型同时具有四至五个SNPs时OR值将达到4.47；若将前列腺癌家族史也当做一项危险因素时(单独OR值为2.22),则具备六项危险因素中的五项甚至全部时,其OR值高达9.46(P=1.29×10-8)。该研究结果表明,多个SNPs联合分析有助于提高人群前列腺癌患病风险的预测效力。日本冈山大学研究小组通过筛选癌症相关基因中的48个错义SNPs(非同义SNPs),发现其10个基因中共计12个SNPs对前列腺癌发病有重要影响。这10个基因包括5个肿瘤抑制基因、2个DNA修复基因、1个代谢酶基因、1个染色体分离相关基因和1个凋亡调节基因,其中9个SNPs与肿瘤的相关性是首次被发现。这12个SNPs在预测前列腺癌患病风险方面同样具有累积效应,它们确定的最高风险组与低风险组人群相比其OR值高达47.4。最高风险组在今后30年间前列腺癌患病的风险是29%,而低风险组为0.6%,其中最低风险组仅约0.2%。因此,通过整合多个肿瘤相关SNPs进行肿瘤患病风险遗传学评估,进一步提高前列腺癌高风险人群的筛查准确性和效率,并有利于肿瘤的预防和早期诊断。由于地理位置和人种起源相近,中国人群与日本人群在遗传背景上具有很大的相似性。在日本人群大规模筛选获得的前列腺癌风险SNPs也有可能部分适用于中国人群,为了验证这一假设,并进一步将在日本人群中获得的研究成果拓展到中国及亚洲其它国家,中国、日本、韩国和新加坡四国共同发起了一项国际多中心研究,旨在检验上述前列腺癌风险SNPs在亚洲其他人群中的效力。本文中所选位点是来源于日本冈山大学研究小组的成果、同该多中心研究内容一致。目的和意义：1、分析前列腺癌组和对照组人群中多个特定单核苷酸多态性位点的分布情况,探讨多个特定位点与广州汉族人群前列腺癌患病风险的相关性,寻找阳性位点以用于指导前列腺癌的预防和早期诊断。2、尝试建立多个阳性单核苷酸多态性位点联合分析广州汉族人群前列腺癌患病风险的预测模型。方法：自2012年6月至2013年7月,在南方医科大学珠江医院、广东省人民医院招募112例前列腺癌(Pea)患者和104例非前列腺癌及其他恶性肿瘤患者(对照组)。两家医院均位于广州,受试者均为汉族男性。病例组为经穿刺活检或术后病理确诊的前列腺癌患者,初次发病或复诊均可。对照组为非前列腺癌及其他恶性肿瘤患者,在年龄上与病例组患者保持匹配,也是在相同时期相同的医疗单位住院或门诊就诊的患者。记录患者的临床资料如发病时年龄、PSA、Gleason评分、TNM分期、治疗方式及治疗效果等,并向患者发放调查问卷,调查内容包括吸烟史、饮酒史、家族史、饮食习惯等。经患者签署知情同意书后,抽取的2m1外周静脉血采用EDTA抗凝管在-20℃(或-80℃)条件下保存。采用TIANampBloodDNAKit血液基因组DNA提取试剂盒进行全血基因组DNA提取。利用多重SNaPshotSNP分型技术对收集到的DNA进行基因分型,所观察的8个位点以所在基因命名分别为SMARCAD1SNP、RAD17SNP、AXIN2SNP、CASP9SNP、PSMD8BP1SNP、DCLREIBSNP、MMP27SNP、BARD1SNP。统计学处理：采用Pearson’sX2检验的方法对对照组每个SNP位点基因型分布情况进行Hardy-Weinberg平衡检验并通过R语言实现。计算各临床指标在病例组和对照组之间的差异或者不同基因型之间的差异时采用Pearson’sX2检验。采用logistic回归分析计算特定基因型与所研究人群前列腺癌发病风险的比值比(ORs)、95%可信区间(Confidenceintervals,CIs)及相应的P值,以分析前列腺癌和基因型的相关性。将年龄和肿瘤危险度对与前列腺癌患病风险相关的SNPs进行分层分析。其中,年龄方面前列腺癌组采用初次发病的年龄、对照组采用招募入组时的年龄,最终分为>72岁组和≤72岁组。在肿瘤危险度方面,分为局限型前列腺癌和进展型前列腺癌。局限型前列腺癌组须同时满足以下标准：TNM分期T1-2;NO/NX;MO/MX;Gleason评分2-7分；PSA≤50ng/ml。进展型前列腺癌组须满足如下条件之一：TNM分期T3/4;N+;M+;Gleason评分8-10分；PSA>50ng/ml。将年龄、吸烟及饮酒状况作为前列腺癌患病风险多因素回归模型的混杂因素。所用统计学软件为SPSS20.0,所有统计检验为双侧检验,计算结果P值<0.05时认为差异有统计学意义。结果：1、选定的8个SNPs基因型(或等位基因)分布与前列腺癌发病风险的相关性分析：无论对年龄、吸烟、饮酒等混杂因素校正与否,SMARCAD1SNP.CASP9SNP、PSMD8BP1SNP、DCLRE1BSNP、MMP27SNP、BARD1SNP计算结果P值均大于0.05,提示病例组和对照组基因型(或等位基因)之间的差异无统计学意义。而经初步相关性分析,提示RAD17SNP和AXIN2SNP[rs2240308]与前列腺癌存在相关性。因RAD17SNP在对照组中基因型的分布经Hardy-Weinberg平衡检验结果为P=0.0324,故认为其人群代表性有一定局限性,本文不做进一步计算,只对AXIN2SNP[rs2240308]进一步统计分析。AXIN2SNP[rs2240308]GG基因型在病例组(59.2%)中的频率明显高于对照组(39.0%),GA基因型在病例组中的频率(30.1%)低于对照组(52.0%)。G等位基因在病例组中的频率(74.3%)高于对照组(65.0%),相反,A等位基因在中对照组的频率(35.0%)高于病例组(25.7%)。GA基因型携带者与GG基因型(作为参考)携带者相比,其校正OR值为0.377(95%CI:0.206-0.688,P=0.001),有统计学意义。AA基因型携带者与GG基因型携带者相比,其校正OR值为0.830(95%CI：0.309-2.232,P=0.712),无明显统计学意义。G等位基因(作为参考)与A等位基因在病例组和对照组之间的差异仍具有统计学意义(P=0.048),其校正OR值为0.649,95%CI：0.422-0.996。2、对阳性位点AXIN2SNP[rs2240308]按年龄分层进行分析：GA基因型携带者在≤72岁组(校正OR=0.419,95%CI:0.181-0.969,P=0.042)和>72岁组(校正OR=0.364,95%CI:0.150-0.879,P=0.025)均提示前列腺癌的患病风险相比GG基因型(作为参考)携带者下降。A等位基因携带者在≤72岁组提示患病风险下降(校正OR=0.514;95%CI:0.281-0.940；P=0.031),但在>72岁组未发现有统计学意义(校正后P=0.646)。3、对阳性位点AXIN2SNP[rs2240308]按肿瘤危险度分层进行分析：GA基因型携带者在局限型组(校正OR=0.246,95%CI:0.100-0.607,P=0.002)和进展型组(校正OR=0.446,95%CI:0.228-0.873,P=0.018)均提示前列腺癌的患病风险相比GG基因型(作为参考)携带者下降。A等位基因携带者在局限型组提示患病风险下降(校正OR=0.408;95%CI:0.206-0.807:P=0.010),但在进展型组未发现有统计学意义(校正后P=0.271)。从另一方面看,通过分层分析,我们可以发现A等位基因在≤72岁组和局限型组中患病风险下降。4、AXIN2SNP[rs2240308]基因型和临床指标之间的关系：各临床指标在GG基因型组和non-GG基因型组之间差异均无统计学意义。结论：通过病例对照研究发现,Axin2SNP[rs2240308]与广州汉族人群前列腺癌可能具有相关性。Axin2SNP[rs2240308:G/A]中的GA基因型对广州汉族人群前列腺癌患病风险中可能呈现保护性作用。据我们所知,本研究为首次发现Axin2SNP[rs2240308:G/A]和前列腺癌患病风险可能具有相关性。Axin2SNP[rs2240308]可能会成为前列腺癌的早期诊断和易感性评估的生物学标志物。
【作者】马超；
【导师】刘春晓；
【作者基本信息】南方医科大学，泌尿外科（专业学位），2014，博士
【关键词】单核苷酸多态性；前列腺癌；易感性；

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