p140Cap在结直肠癌增殖、侵袭和转移的作用

【摘要】背景和目的p140Cap主要表达于大脑、睾丸以及富含上皮的组织如乳腺、肺、肾和大肠。关于p140Cap在人类肿瘤组织中表达的报道还比较少。近期一项乳腺癌的筛查中发现,在伴有淋巴结转移和高度增殖的肿瘤组织中,p140Cap的阴性表达率高达70%,说明p140Cap表达与肿瘤的恶性程度成负相关。另外一项研究结果显示,乳腺癌中Srcinl基因的mRNA表达水平与预后不良因素有一定的相关关系。目前对p140Cap对大肠癌的影响的研究甚少,本实验于基于临床标本,质粒过表达、RNAi干扰细胞株,裸鼠原位移植瘤,从组织水平、细胞水平以及体内水平研究pl40Cap对大肠癌增殖、凋亡、转移侵袭的影响。材料和方法1.p140Cap在癌旁和结肠癌组织中的表达：南方医院胃肠外科手术室收集23对肠癌组织和对应的癌旁组织,应用Westernblot法检测p140Cap蛋白表达,GAPDH为内参。2.p140Cap在癌旁和结肠癌组织中的表达：南方医院消化科内镜室收集126对以上同一患者结肠癌组织及癌旁正常组织(>5cm)标本,制作组织切片,应用免疫组化染色(IHC)检测p140Cap表达,判断阳性表达,并收集年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移、浆膜浸润、组织病理学分型、TNM分期等临床病理资料,Pearsonχ2检验。3.p140Cap在结肠癌转移淋巴结组织的表达：南方医院胃肠外科手术室收集25例结肠癌转移淋巴结组织,应用免疫组化染色(IHC)检测p140Cap表达。4.p140Cap在结肠息肉表达：南方医院消化科内镜室收集38例大肠增生性息肉、42例腺瘤性息肉,制作石蜡切片,免疫组织p140Cap的表达,观察p140Cap在细胞表达部位和强度的差异。进行了p140Cap在大肠组织中表达分布差异分析,并与结肠癌阳性表达进行比较。5.p140Cap在肠癌细胞系中的表达：收集南方医院实验室保存的8个LS174T,SW620,SW1116,LoVo,SW480,Caco-2,DLD1和HT29等肠癌细胞株,提取细胞总蛋白,应用Westernblot方法检测p140Cap蛋白表达。6.建立p140Cap稳定过表达细胞株(p140Cap-pcDNA3.1,pcDNA3.1为其阴性对照株)：化学合成全基因,酶切pcDNA3.1质粒载体,重组目的质粒p140Cap-pcDNA3.1,PCR验证并测序。lipofectamine2000稳定转染p140Cap-pcDNA3.1质粒到LoVo细胞,G418筛选,WesternBlot验证。7.建立瞬时敲低p140Cap表达细胞株(p140Cap-siRNA,siRNA为其阴性对照株)：lipofectamine2000瞬时转染p140Cap-siRNA到LoVo细胞,G418筛选,WesternBlot验证。8.p140Cap对结肠癌细胞侵袭转移的影响：划痕实验、侵袭小室实验检测过表达或敲低p140Cap细胞对侵袭转移能力的作用。9.建立稳定敲低p140Cap表达细胞株(p140Cap-shRNA,shRNA为其阴性对照株)：以5MOI、10MOI、20MOI不同滴度的p140Cap-shRNA漫病毒分别感染LoVo细胞,荧光显微镜下观判断察感染效率,Westernblot验证。10.p140Cap对细胞增殖影响：WST-1实验和平板细胞克隆形成实验检测稳定过表达或敲低p140Cap细胞对细胞增长速度的作用。11.p140Cap对细胞凋亡影响：流式细胞技术检测敲低p140Cap细胞对细胞凋亡作用,分析凋亡细胞比例。12.建立裸鼠原位移植瘤模型以及评估5-Fu对原位移植瘤生长影响：分别将shRNA,p140Cap-shRNA两组细胞(5×106/0.1mL)皮下接种到5周龄雄性BALB/c-nu/nu裸鼠的右侧背部各10只,2周后原位移植瘤长至长径5mm左右时,予注射有感染p140Cap-siRNA或siRNA细胞的裸鼠腹腔注射5-Fu(20μg/g,每2天1次,共两周)或生理盐水(100μl/只,每2天1次,共3周)各五只。每两天观察生长情况,每周测量肿瘤体积,计算肿瘤生长抑制率,5周后取肿瘤组织HE染色。13.p140Cap与Raf-MEK-ERK信号转导通路：Westernblot分别检测p140Cap-shRNA或shRNA两组细胞ERK1/2、phospho-ERK1/2、MEK1、phospho-MEK1的表达,并进一步检测凋亡相关蛋白Capase3、8、9、Bcl2,以及增殖相关蛋白CyclinD1、p21、p27的表达。14.统计学分析：数据以X±s表示,采用SPSS16.0统计软件,率的比较采用Pearsonx2或fisher检验,细胞增殖、凋亡、侵袭转移采用独立实验t检验,裸鼠肿瘤体积的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行统计学处理,以P<0.05为差异具显著性。结果1.Westernblot证实73.9%肠癌组织p140Cap表达高于对应癌旁组织(17/23)。2.p140Cap在癌旁、结肠腺瘤和结肠癌组织以及结肠癌转移淋巴结中的表达：经免疫组化SP法染色的阳性物质为黄色颗粒,主要定位于细胞浆中。结肠癌组织p140Cap阳性表达率(评分大于4分,++/+++)在为85.7%(108/126)；癌旁正常组织p140Cap阳性表达率为12%(6/50),,结肠腺瘤p140Cap阳性率为38.1%(16/42),非肿瘤性息肉p140Cap阳性率为15.8%(6/38),结肠癌转移淋巴结p140Cap阳性率为100%(25/25)。经统计分析,结肠癌组织p140Cap表达阳性表达率高于癌旁组织(P<0.001)。3.结肠癌组织中p140Cap表达与临床病理特征的关系：结肠癌p140Cap阳性表达率与性别、年龄、肿瘤位置无显著性差异(P<0.05)；与肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移、浆膜浸润、组织病理学分型及TMN有显著性差异(P<0.05)。4.p140Cap在肠癌细胞系中的表达：8株结直肠癌细胞系中p140Cap蛋白均有高或较高的表达水平,而293T不表达。5.成功构建p140Cap-pcDNA质粒：化学合成的p140Cap基因片段重组到pcDNA3.1质粒,转化到感受态细胞,扩增后提取质粒,琼脂糖凝胶电泳验证分子量符合,基因测序测通成功。6.成功建立p140Cap过表达细胞株：经过WesternBlot验证筛选出的第7个单克隆LoVo(Clone7)p140Cap表达最高,命名为p140Cap-PcDNA3.1细胞株,其阴性对照pcDNA3.1质粒转染LoVo命名为pcDNA3.1细胞株,选择p140Cap表达最高的p140Cap-PcDNA3.1株,进行下一步研究。7.siRNA干扰敲低LoVo细胞p140Cap表达：WesternBlot检测发现,由3条p140Cap-siRNA瞬转的3株LoVo细胞p140Cap均被敲低,p140Cap-siRNA2感染株p140Cap最低,命名为p140Cap-siRNA株。8.p140Cap促进对结肠癌细胞侵袭转移：划痕实验发现,p140Cap上调的细胞划痕48h后显微镜下观察划痕宽度变窄(P<0.01,三次独立试验)；侵袭小室实验发现,36h后p140Cap上调的细胞穿过小室的细胞增多(P<0.01,三次独立试验),同理p140Cap下调则相反。9.建立稳定敲低p140Cap表达细胞株：利用慢病毒敲低p140Cap,p140Cap-shRNA感染LoVo,48h荧光显微镜下观查20MOI滴度p140Cap-shRNA感染率达到90%以上,Westernblot证实p140Cap表达下调,命名为p140Cap-shRNA株。10.p140Cap促进结肠癌细胞增殖：WST-1实验证实p140Cap上调促进细胞生长(第3,5,7天),平板细胞克隆形成实验显示p140Cap上调克隆数量增加P<0.01,三次独立试验)。p140Cap下调则相反。11.p140Cap抑制结肠癌细胞凋亡：流式细胞技术检测显示,p140Cap-shRNA组的细胞凋亡率(Q2+Q3)高于对照组shRNA组(P<0.01,三次重复试验)。12.p140Cap下调抑制裸鼠原位移植瘤生长,增加裸鼠对5-Fu化疗敏感性：接种细胞5周后,20只裸鼠无死亡,均有肿瘤生长,解剖后未发现其它肺、肝组织有转移结节,HE证实原位移植瘤为恶性肿瘤组织,显示敲低组较之对照组肿瘤坏死面积小。接种细胞5周后,测得各组种植瘤体积shRNA+生理盐水组(1485.2±224.7)、shRNA+5-FU组(595.5±117.3)、p140Cap-shRNA组+生理盐水组(581.4±139.7)(mm3)、p140Cap-shRNA+5-FU组(240.6±78.3)(mm3),经统计学分析,p140Cap-shRNA+生理盐水组,p140Cap-shRNA组+生理盐水组、p140Cap-shRNA+5-FU组三组肿瘤体积与shRNA+生理盐水组比差异有显著性(P<0.05,One-WayANOVA)。13.p140Cap参与Raf-MEK-ERK信号转导通路影响结肠癌细胞增殖和凋亡：p140Cap-shRNA组phospho-ERK1/2、phospho-MEK1的表达shRNA组细胞ERK1/2,MEK1的表达。p140Cap-shRNA组shRNA组细胞较的活性Capase3、8、9,p21、p27表达增高,Bcl2,CyclinD1表达降低。结论1.p140Cap在大肠癌组织高表达,并且与某些预后相关的大肠癌临床病理分型存在显著差异,可能影响大肠癌不良预后。2.p140Cap在大部分大肠癌细胞浆高表达,少部分大肠腺瘤表达,正常组织极少表达,可能在大肠癌发展的过程中发挥促癌作用。3.p140Cap在结肠癌细胞高表达,p140Cap促进肠癌细胞生长、转移和侵袭,抑制凋亡。4.p140Cap下调表达抑制裸鼠原位移植瘤的生长,增加裸鼠对5-Fu药物敏感性。5.p140Cap参与Raf-MEK-ERK信号转导通路,从而影响细胞增殖与凋亡。6.p140Cap在在大肠癌的发生发展中表现为癌基因的特性,为预测大肠癌预后的一个新的分子标志物。
【作者】马锋；
【导师】张亚历；王继德；
【作者基本信息】南方医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】p140Cap；大肠癌(CRC)；息肉；增殖；凋亡；侵袭；

【参考文献】
[1]郭阳.青年团员激励机制研究[D].武汉科技大学,工商管理,2012,硕士.
[2]张纯学.美国21世纪的对陆攻击驱逐舰——DD21[J].飞航导弹.2001(03)
[3]谢雪宇.基于空气负离子资源的森林公园保健养生项目规划研究[D].中南林业科技大学,园林植物与观赏园艺,2014,硕士.
[4]逯鹏飞.基于高分辨率卫星影像的城市内部变化信息提取[D].西南大学,地图学与地理信息系统,2014,硕士.
[5]谢磊,刘雪芹,张建明,王树青.基于NGPP-SVDD的非高斯过程监控及其应用研究[J].自动化学报,2009,01:107-112.
[6]李桔松.清末民初三多诗词研究[D].内蒙古大学,中国古代文学,2013,硕士.
[7]裴正林.任意起伏地表弹性波方程交错网格高阶有限差分法数值模拟[J].石油地球物理勘探,2004,06:629-634+621-751.
[8]王青.白洋淀湿地对干旱的适应机制及综合调控研究[D].东华大学,环境科学,2013,硕士.
[9]苏微.毒驾入刑问题探析[D].沈阳师范大学,法律,2013,硕士.
[10]高鸣.人羊膜修复腱鞘缺损的实验研究[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[11]冯秦源.浅论清初在京畿地区的圈地[D].首都师范大学,专门史,2013,硕士.
[12]韩伟华.c-Met抑制剂PHA-665752联合5-FU，CDDP对结肠癌移植瘤生长的影响及相关机制[D].河北医科大学,外科学,2014,硕士.
[13]陈明秋.电渣重熔钢锭动态温度场及微观组织的研究[D].东北大学,工程热物理,2010,硕士.
[14]王凤仙.以聚乙烯醇为基材的吸湿薄膜研究[D].上海海洋大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[15]邵建伟.北京市高校男子高水平排球运动员身体素质训练情况研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[16]李良.长治市初中运动技能教学现状的调查与研究[D].内蒙古师范大学,运动训练（专业学位）,2013,硕士.
[17]耿兆云.汽车非线性悬架控制策略研究[D].广西科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[18]林立娜.乡土文化资源在《文化生活》教学中的运用研究[D].河北师范大学,教育,2013,硕士.
[19]袁灿兴.国际人道法在华传播与实践研究（1874-1949）[D].苏州大学,中国近现代史,2014,博士.
[20]金萍,孔繁华,张元健.连铸机电磁搅拌技术[J].一重技术.1999(03)
[21]张元治.《太平经》单音节同义词研究[D].湖南师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[22]吴雪慧.词汇注释与目的性对阅读中词汇习得的影响[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[23]嵇珊珊.我国社会保障基金投资运营风险防范研究[D].山东财经大学,社会保障学,2014,硕士.
[24]林乾.偏瘫足下垂患者使用腰部吊带式膝踝足矫形器的三维步态分析[D].天津体育学院,康复医学与理疗学,2013,硕士.
[25]朱子华.广州市番禺区钟村街城市更新改造研究[D].吉林大学,公共管理,2014,硕士.
[26]魏亚强.二战中核武器的使用及反思[D].西北师范大学,世界史,2013,硕士.
[27]袁艺.改革开放后景德镇古彩瓷创作发展研究[D].景德镇陶瓷学院,设计艺术学,2014,硕士.
[28]荣晓玲.CTPA与肺灌注/通气现象在诊断肺栓塞中的对比研究[D].青岛大学,放射医学,2013,硕士.
[29]刘煜,王浩江,杨育农.聚丙烯材料耐候性能研究进展[J].合成材料老化与应用,2013,06:48-53.
[30]李健美.唐鉴学术思想初探[D].湘潭大学,专门史,2003,硕士.
[31]江玲玲.网络舆论影响司法审判量刑的研究[D].江西财经大学,传播学,2013,硕士.
[32]郑向阳.数据挖掘技术及其在城建档案信息服务中的应用[J].档案学通讯,2005,03:77-79.
[33]岗本佳子.日中政府资助民办大学政策的比较研究[D].华东师范大学,高等教育学,2004,硕士.
[34]刘玉梅.胡柚皮膳食纤维的提取及理化性质的研究[D].中南林业科技大学,森林食品加工与利用,2013,硕士.
[35]黄粤.吴川市社会力量参与公共文化建设的研究[D].西南交通大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[36]杨琦.小洼油田稠油脱硫工艺技术研究[D].东北石油大学,石油与天然气工程（专业学位）,2013,硕士.
[37]卢俊坤.BFRP筋海砂混凝土梁受弯性能试验研究[D].广东工业大学,结构工程,2014,硕士.
[38]戴垚垚.维生素D及其代谢通路遗传多态与结核病发病风险和预后的关联研究[D].南京医科大学,流行病与卫生统计学,2013,硕士.
[39]于波.社会管理创新视角下的我国电视媒体社会导向研究[D].沈阳师范大学,公共管理,2014,硕士.
[40]汤跃跃.国有股权流通问题研究[D].湘潭大学,政治经济学,2001,硕士.
[41]张峰,许新强.井巷工程中的流态混凝土支护系统与技术[J].金属矿山.2003(07)
[42]赵宇阳.射频消融治疗频发室性早搏的回顾性分析及评价[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[43]王涵.社区养老服务多元供给主体的角色定位研究[D].首都经济贸易大学,社会保障,2014,硕士.
[44]黄涛.B/S结构网络在线考试系统的设计与实现[D].燕山大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[45]江浩.电厂运行优化决策支持系统设计方案[J].电力系统自动化,2004,05:75-79.
[46]唐圆.股权激励对上市公司过度投资的影响研究[D].南京财经大学,金融学,2013,硕士.
[47]张挹新.如何提高引进复合罐生产线的生产能力[J].中国包装.1989(01)
[48]严玉.一个基于统计技术的苏州市自来水公司数据挖掘系统[D].苏州大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[49]华科,谢开,郭志忠.计及无功电价波动的综合输电权拍卖及其内点法实现[J].电力系统自动化,2007,06:17-22.
[50]周士钧.诉讼时效期间起算及中断事由研究[D].华东政法学院,法律,2003,硕士.