MxA基因启动子多态性与慢性乙型肝炎替比夫定治疗HBeAg血清学转换的研究

【摘要】研究背景：乙型肝炎病毒(HBV)感染已经成为严重影响我国人民健康的公共卫生问题。慢性乙型肝炎是一种进展性、难治性的传染病,持续高病毒载量与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关。有效规范的抗病毒治疗可以最大限度地长期抑制乙肝病毒,减轻肝细胞炎症坏死和肝纤维化,延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞癌及其并发症的发生,从而改善患者生活质量和延长生存期,因此抗病毒治疗是改善慢性乙型肝炎病情和预后的重要措施。目前临床上应用治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药物主要有干扰素和核苷(酸)类似物,后者能迅速有效地抑制乙肝病毒复制,减少血液和肝脏内病毒的载量,减轻肝组织炎症、坏死和肝纤维化,且由于服用方便、安全性好而广泛应用于临床。替比夫定虽然在欧美乙肝指南中未被列为治疗慢性乙型肝炎的一线药物,但在慢性肝炎高发的亚太地区其仍具有广阔的应用市场。虽然有效抑制病毒复制能够改善患者的临床预后,但是由于目前的抗病毒药物无法清除肝细胞核内的HBVcccDNA,停药后容易复发,因此持久抑制病毒复制还有赖于机体自身免疫功能的恢复。由于HBeAg和HBsAg是T细胞依赖性抗原,B细胞产生HBeAb或者HBsAb需要辅助性CD4+T细胞的参与,而HBcAg因可组成颗粒性结构,是T细胞依赖性及非T细胞依赖性抗原,即使乙型肝炎患者细胞免疫低下,体内仍可出现HBcAb。因此HBsAg或HBeAg血清学转换是特异性免疫应答的过程,针对乙肝病毒特异性抗体HBsAb或HBeAb的出现可反映机体免疫功能的改善。抗病毒治疗的理想终点是HBsAg消失(伴或不伴HBsAb的出现),然而当前可用的抗乙肝病毒药物很少能实现这一目标,因此,对于HBeAg阳性慢性乙肝患者,治疗后获得HBeAg血清学转换是满意的治疗终点。研究证明,HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者经抗病毒治疗后出现HBeAg血清学转换,可使肝脏病变好转,减少和阻止肝硬化和肝细胞癌的发生,并有进一步发生HBsAg转阴或血清学转换的可能,可作为持久疗效和停药的指标。因此,国内外肝病学会的指南均把HBeAg血清学转换作为HBeAg阳性慢性乙肝患者抗病毒治疗重要的停药指标。HBeAg血清学转换虽然有可能发展至HBsAg血清学转换,但也有患者可因免疫功能降低而再度转为HBeAg转阳,HBeAb阴性。单独HBeAg消失而未出现HBeAb,可能是因为HBV被抑制而导致相应分泌蛋白降低或消失,反映病毒被抑制而并非免疫功能好转。在部分乙型肝炎患者中,可因乙肝病毒基因前C或C启动子区突变而致HBeAg阴转或表达下降,从而转为HBeAg阴性肝炎。因此,在出现HBeAg血清学转换时应同时检测血清HBVDNA和ALT水平,以全面考核治疗效果。替比夫定通过直接抑制HBVDNA聚合酶发挥抗病毒作用,临床上为达到持续抑制病毒复制的目标,大部分患者需要长期接受抗病毒治疗,在长期治疗过程中病毒耐药成为临床最棘手的难题,同时由于存在包括感染途径、病程长短、性别、年龄、宿主遗传背景、肝脏病变程度及病毒载量等诸多因素,不同慢性乙型肝炎患者使用替比夫定治疗后出现的应答情况各不相同,因此,发现影响药物疗效的因素,寻找对治疗应答最好的人群,在规范化治疗的过程中根据患者的具体情况实施个体化治疗,以提高长期抗病毒治疗的疗效和减少耐药性的产生。GLOBE临床研究数据的多因素logistic回归分析结果显示,在HBeAg阳性受试者中,基线HBVDNA<9log10copies/mL,ALT≥2×ULN且24周HBVDNA检测不到水平的患者中,治疗2年后HBeAg血清学转换率达52%,可见即使对替比夫定治疗应答最好的患者群体,仍有接近一半患者在治疗2年后无法获得HBeAg血清学转换。部分患者即使HBVDNA维持检测不到水平很长一段时间,仍然无法达到HBeAg血清学转换,其差异可能与宿主的免疫功能有关。研究表明HBeAg阳性患者血清高水平的IL-10和IL-12水平与早期自发的HBeAg血清学转换有关,而基因启动子的多态性影响了细胞因子水平,可见宿主的免疫功能在一定程度上受宿主遗传背景的影响。MxA是干扰素诱生的天然免疫蛋白,体外研究证实MxA蛋白对乙型肝炎病毒具有抗病毒活性。对表达MxA蛋白的干扰素受体缺失转基因小鼠的研究表明,在雌性小鼠体内MxA蛋白可通过降低HBV复制中间体的合成进而抑制病毒HBeAg,衣壳蛋白表达和HBV复制,进一步在体内证实了MxA蛋白的抗HBV复制活性。最新的研究证实MxA通过其中心反应区域直接与HBV核心蛋白相互作用,导致HBcAg在细胞核周间隙累积,限制了HBcAg的肝细胞内动力学,阻碍了病毒颗粒在肝细胞内的组装。但另一方面,HBV能够在人体内持续复制导致慢性化,表明其可逃避机体的抗病毒作用,提示HBV可能拮抗或反作用于MxA的抗病毒活性。体外试验研究发现HepG2细胞内HBV复制能抑制干扰素诱导的MxA基因转录和蛋白表达。应用HBcAg和HBeAg表达载体分别和MxA启动子活性载体转染HepG2细胞后发现HBcAg和HBeAg能明显下调MxA启动子活性,EMSA显示HBcAg和HBeAg能直接作用于MxA基因启动子,这些研究结果表明HBV通过前C/C蛋白与MxA启动子区直接作用下调MxA的表达,抑制机体MxA蛋白的抗病毒活性,证实了上述对HBV慢性感染机制的假设。目前对MxA基因启动子区域多态性位点的研究主要集中于-88G/T(rs2071430)和-123C/A(rs17000900),其中,-88G/T(rs2071430)SNP位点正好位于干扰素刺激反应元件(ISRE)序列内,此位点等位基因T取代等位基因G可以使MxA基因的这段基序与ISRE具有更高的同源性,能够更好的发挥ISRE效应。目前诸多研究都以其基因启动子SNP作为切入点进行研究。已有研究结果表明MxA基因启动子区的单核苷酸多态性,尤其是-88位点G/T多态性不仅与丙型肝炎的进程和干扰素的治疗效果有关,也与干扰素治疗慢性乙型肝炎患者发生HBeAg血清学转换有关联,表明MxA基因启动子SNP在干扰素治疗反应的机制发挥重要作用并可做为一个可靠的预测因子。随着个体化抗病毒治疗的发展,抗病毒治疗疗效中预测因素,特别是相关的宿主遗传因素引起了人们的关注。既往研究多关注于干扰素治疗应答,且未能消除乙肝病毒学因素对治疗应答的影响,对于宿主的遗传因素影响核苷类药物抗病毒治疗应答的研究并不多见。考虑不同个体的遗传因素可能通过MxA基因的多态性对慢性乙型肝炎的发病、抗病毒的疗效产生重要影响,在均衡化病毒学因素影响的前提下,研究宿主的MxA基因多态性与核苷类抗病毒药物诱导的HBeAg血清学转换之间的关系更能反映宿主遗传背景对机体免疫功能的影响,有助于深入认识宿主遗传背景差异对抗病毒疗效的影响,对于指导个体化治疗和合理用药,提高药物使用的有效性和经济性,具有非常重要的临床意义。研究目的：研究MxA基因启动子多态性和HBeAg阳性CHB患者替比夫定抗病毒治疗HBeAg血清学转换的关系,揭示宿主遗传背景在慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答中的作用,为指导临床用药和个体化治疗提供理论依据。研究方法：1.以参与替比夫定优化治疗临床研究的91例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者(基线HBVDNA<9log10copies/mL,ALT≥2×ULN且24周至104周HBVDNA持续维持检测不到水平)为研究对象,根据治疗104周的应答情况分为完全应答组(HBeAg阴性,HBeAb阳性,ALT正常)和非完全应答组(未能获得HBeAg血清学转换),比较两组间的人口学和基线临床指标；2.以MxA基因启动子上的2个SNP位点(rs2071430和rs17000900)为候选位点,根据MxA基因启动子序列,扩增目的片段后直接测序进行基因分型,分析位点基因型频率在完全应答组和非完全应答组之间分布的差异,发现与替比夫定治疗104周HBeAg血清学转换相关联的阳性位点；3.应用Haploview软件分析MxA基因启动子区2个SNP位点之间的连锁不平衡情况,PHASE软件构建2个SNP位点可能具备的单体型,分析不同单体型频率在完全应答组和非完全应答组之间的分布差异；4.将研究对象以年龄(<30岁和≥30岁)和rs2071430位点基因型(TT/GT和GG)为分层条件分为四组,分别为populationⅠ(rs2071430TT/GT基因型且年龄<30岁)、populationⅡ(rs2071430TT/GT基因型且年龄≥30岁)、populationⅢ(rs2071430GG基因型且年龄<30岁)、populationⅣ(rs2071430GG基因型且年龄≥30岁),分析各个群体治疗104周时HBeAg血清学转换率并比较不同分层群体之间的差异；5.对单因素分析得到的与HBeAg血清学转换有关的影响因素应用非条件logisitic回归分析,校正年龄、性别、乙肝病毒基因型等因素,观察与HBeAg血清学转换有关的独立影响因素；6.应用Cox比例风险回归模型,校正年龄,性别,病毒基因型等因素后,比较rs2071430位点不同基因型治疗104周的累积HBeAg血清学转换率的差异；7.根据rs2071430位点不同基因型将研究对象分为2组(TT/GT和GG),比较两组患者人口学和基线临床指标的差异；8.将含rs2071430位点不同等位基因的MxA启动子片段(603bp)插入到pGL3-Basic构建等位特异性重组表达载体,与内对照质粒pRL-TK共同转染HepG2和HuH7细胞,在给予不同浓度干扰素α-2a(100IU/ml和1000IU/ml)刺激情况下,比较不同等位重组载体的相对荧光素酶表达活性；9.合成rs2071430位点不同等位生物素标记探针,提取应用干扰素α-2a(1000IU/ml)刺激1小时HepG2细胞的核蛋白,应用EMSA实验在体外观察不同等位探针是否能与核蛋白结合,并通过冷探针竞争实验观察两种等位探针与核蛋白结合的特异性,应用QuantityOne软件定量分析rs2071430位点两种等位特异性探针与核蛋白的结合能力之间的差异。10.统计学处理SNP位点的Hardy-Weinberg平衡由χ2检验分析,以P>0.05为符合Hardy-Weinberg平衡。HBVDNA、HBeAg和HBsAg定量以常用对数进行数据转换,正态分布计量资料以均数±标准差(x±sd)表示,非正态分布计量资料以中位数(25-75%百分位数)表示,正态分布的组间比较应用参数t检验,非正态分布的组间比较应用非参数Mann-WhitneyU检验,组间计数资料的比较应用χ2检验；采用二元非条件logistic回归分析宿主基因型与替比夫定抗病毒治疗后HBeAg血清学转换的关系,校正年龄、性别、乙肝病毒基因型等因素；采用Cox比例风险回归模型分析不同宿主基因型累积HBeAg血清学转换率的差异,校正年龄、性别、乙肝病毒基因型等因素。使用Haploview4.2软件检测SNP位点连锁不平衡,PHASE2.1软件构建单体型,采用二元非条件logistic回归分析单体型与替比夫定抗病毒治疗后HBeAg血清学转换的关系,校正年龄、性别等因素。不同等位重组载体的相对荧光素酶表达活性比较采用参数t检验。应用GraphPadPrism5软件对分析结果进行作图。统计分析采用SPSS13.0软件包(SPSS,Inc.,芝加哥,美国)进行,所有统计检验均为双侧检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果：1.根据治疗104周的应答情况,完全应答组有50例,非完全应答组有41例。在单因素分析中,rs2071430基因型和年龄是影响治疗后HBeAg血清学转换的因素。与rs2071430GG基因型个体相比,携带T等位基因的个体在替比夫定治疗104周后更易获得HBeAg血清学转换(共显性模式：OR=2.13,95%CI=1.20-6.65,χ2=5.821,P=0.016)。CR组的平均年龄低于NCR组,两组之间差异具有统计学意义(27.3±6.6vs31.3±9.3,t=-2.293,P=0.025)。2.MxA基因启动子区2个SNP位点rs2071430和rs17000900之间存在连锁不平衡(产=0.34),应用PHASE软件构建出的4种单体型,其中AG单体型在两组中的频率均小于5%,而且在CR组中未能构建出此单体型。将AG与AT单体型合并分析,3种单体型(CG/CT/AG+AT)的频率分布差异在CR组和NCR组之间无统计学意义(χ2=4.250,P=0.119)。在显性模式下,经非条件logistic回归分析校正年龄和性别因素,个体AT单体型的频数分布在CR组和NCR组之间差异无统计学意义(P=0.071)。3.将研究对象以年龄(<30岁和≥30岁)和rs2071430位点基因型(TT/GT和GG)为分层条件分为四组,分别为populationⅠ(rs2071430TT/GT基因型且年龄<30岁)、populationⅡ(rs2071430TT/GT基因型且年龄≥30岁)、populationⅢ(rs2071430GG基因型且年龄<30岁)、populationⅣ(rs2071430GG基因型且年龄≥30岁),结果显示populationⅠ在治疗结束时HBeAg血清学转换率最高,达到75%(24/32),其次为populationⅡ为50%(7/14),populationⅢ和populationⅣ治疗结束时HBeAg血清学转换率分别为43.4%(10/23)和40.9%(9/22)。populationⅠ与populationⅢ、populationⅣ相比,HBeAg血清学转换率差异具有统计学意义(χ2=5.633,P=0.018;χ2=6.375,P=0.012)。4.经二元非条件logistic回归校正年龄、性别、乙肝病毒基因型等因素后,rs2071430位点与替比夫定治疗后HBeAg血清学转换的关联仍具有统计学意义(P=0.042),与rs2071430GG基因型个体相比,携带T等位基因型的个体在抗病毒治疗104周更易于获得HBeAg血清学转换(显性模式：OR=2.48,95%CI=1.03-5.97),而年龄对HBeAg血清学转换的影响经回归分析后无统计学意义(P=0.058)。5.应用Cox比例风险回归模型分析显示,在校正年龄,性别,病毒基因型等因素后,rs2071430位点携带T等位基因型的患者治疗104周累积HBeAg血清学转换率更高,与GG基因型患者相比,在104周时两者之间累积HBeAg血清学转换率差异具有统计学意义(HR=1.94,95%CI=1.09-3.44,P=0.024)。6.按照rs2071430位点不同基因型对研究对象分组,结果显示乙肝病毒基因型在不同宿主基因型中分布差异具有统计学意义(χ2=5.082,P=0.024),携带T等位基因患者乙肝病毒基因B型所占比例高。和非T等位基因且非病毒基因B型患者相比,携带T等位基因且病毒基因B型的患者其治疗104周后HBeAg血清学转换率虽有升高,但两者之间差异不具有统计学意义(χ2=0.345,P=0.557)。7.将构建的rs2071430等位特异性重组表达载体与内对照质粒pRL-TK共转染HepG2细胞,检测重组载体的相对荧光素酶活性。结果显示在未予处理因素的情况下,不同等位基因重组载体报告基因表达水平差异无统计学意义(t=1.268,P=0.223)。在给予不同浓度干扰素α-2a(100IU/ml和1000IU/ml)刺激情况下,重组载体MxA-T-pGL3-Basic的报告基因表达水平均高于MxA-G-pGL3-Basic载体,两者之间差异均具有统计学意义(t=3.227,P=0.005;t=2.825,P=0.012)。将等位特异性重组表达载体与内对照质粒pRL-TK共转染HuH7细胞,应用不同浓度干扰素α-2a(100IU/ml和1000IU/ml)刺激后可得到相似的结果(t=2.565,P=0.021；t=3.035,P=0.008)。8.EMSA实验表明rs2071430位点不同等位生物素标记探针与核蛋白(来源于干扰素a-2a刺激1小时的HepG2细胞)在体外反应后均可形成DNA-核蛋白复合物。竞争实验结果表明,T、G两种生物素标记的等位探针与核蛋白的结合均能被对应两种冷探针(400倍)竞争性抑制,提示rs2071430位点的两种等位特异性探针与核蛋白结合具有特异性,两种等位探针所结合的核蛋白种类相同。QuantityOne定量分析显示T,G两种等位探针与核蛋白的结合量存在差异,T等位与核蛋白结合量较G等位的提高约90%,提示在给予干扰素处理的情况下,rs2071430位点两种等位特异性探针对核蛋白的结合能力存在差异,T等位的结合能力强于G等位。研究结论：1.MxA基因启动子rs2071430与替比夫定治疗104周HBeAg血清学转换有关联,携带T等位基因患者较G等位患者易于获得HBeAg血清学转换；2.MxA基因启动子rs2071430T等位基因较G等位基因序列具备更强的核蛋白结合活性,表现出更强的启动子活性；3.MxA基因遗传变异可能会影响慢性乙型肝炎患者替比夫定治疗诱导的HBeAg血清学转换。
【作者】唐利波；
【导师】侯金林；
【作者基本信息】南方医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】慢性乙型肝炎；替比夫定；HBeAg血清学转换；MxA基因；单核苷酸多态性；

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