钛基纳米棒的成骨生物学性能初步研究

【摘要】研究背景随着经济发展、社会进步,人们对生活质量的要求不断的提高,人工全髋关节置换术和人工全膝关节置换术近年来在全球范围手术量也急剧上升。虽然人工全髋置换和人工全膝置换手术术式已经几近完美,但是植入物材料的寿命有限(20年左右),已然不能满足现在老龄化的要求。钛及钛合金由于其耐磨性好、抗腐蚀性强、良好的力学性能和生物相溶性而广泛应用于关节植入材料。但是钛属于生物惰性材料,生物活性差,缺乏骨诱导作用。钛假体植入体内后其周围可能形成纤维组织包裹、骨溶解,导致假体松动。腰椎内固定松动是腰椎手术失败术后疼痛的主要常见原因。螺钉表面纳米化修饰,促进成骨,增强螺钉-骨界面融合。通过假体表面设计可赋予其生物活性,促进骨生长,提高骨融合率,提高骨-材料界面的强度,延长假体寿命,是目前研究的热点。纳米技术近年来广泛应用于各个领域,如医药领域、机械领域等。当物质的结构单元(如晶粒或孔隙)小到纳米级,其性质就会发生重大改变,不仅改善了原来材料的性能,甚至使原材料具有新的性能或效应。纳米材料在光学、催化、热学、光化学以及敏感特性等方面具有一系列独特的性质。抛光表面构建纳米结构有望提高细胞的生物学行为。已有大量研究表面纳米表面可影响细胞的生物学行为。Dalby等发现27nm的纳米结构可促进人成纤维细胞生长。另一研究发现,13nm的“纳米岛”结构可促进细胞增殖,基因表达的上调,而95nm的“纳米岛”则抑制细胞的增殖,下调基因表达。Sjostrom等通过铝模版构建不同规格的纳米棒,结果表明15nm长的纳米棒可明显促进hMSCs增殖、分化。不同的纳米长度对细胞可能起到不同的生物学作用。本研究在室温下应用电化学阳极氧化法构建纳米棒形貌,通过调节电化学参数可控制纳米棒长度,简单易行,且无需应用模版。通过构建不同长度的纳米棒形貌,进行体外培养MSCs,研究其对细胞黏附、增殖、成骨分化等影响；通过动物体内实验,研究不同长度的纳米棒表面与骨界面结合能力及强度。目的1、明确钛基纳米棒的表面形态及性质；2、明确钛基纳米棒的生物学相容性；3、明确不同长度的钛基纳米棒对MSCs细胞生物学行为的影响；4、初步探讨不同长度的钛基纳米棒调节MSCs细胞功能的机制；5、探讨钛基纳米棒植入体内后与骨组织的结合程度。研究方法1,材料的制备：选用医用钛片除去钛基片表面的油污和附着物,接着用去离子水冲洗表面。抛光、去离子水冲洗,采用阳极氧化恒流法,以钛箔为阳极,铜片为阴极,采取直接加电流法,分别反应20min,30min,40min制备不同长度的钛纳米棒。2,采用场发射扫描电镜及原子力显微镜观察Ti,30nmTi,100nmTi和120nmTi的表面形态,用能谱分析研究其元素组成；通过蛋白吸附实验研究4种不同的材料表面对蛋白的吸附能力。3,Ti,30nmTi,100nmTi和120nmTi四种材料进行生物相容性实验,采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测细胞培养液,MTT法检测四种材料对L929细胞相对增殖率的影响,钙黄绿素死活染色法观察四种材料表面的细胞状态,从而综合评价纳米表面改性后材料的生物安全性。4,Ti,30nmTi,100nmTi和120nmTi四种材料与骨髓间充质干细胞(MSCs)复合培养,进而研究细胞在四种材料表面上30min、60min及120min的早期细胞黏附,采用扫描电镜研究MSCs细胞在四组材料表面的黏附形态；采用MTT法检测MSCs细胞在四组材料表面1、3、5天增殖活力；MSCs细胞与四组材料复合培养14天后,采用pNPP法测定细胞内碱性磷酸酶含量,用胞内总蛋白进行标准化,观察四组材料对MSCs细胞的成骨分化的影响；MSCs细胞与四组材料复合培养21天后进行茜素红染色,研究四种材料对MSCs矿化的影响。5,Ti,30nmTi,100nmTi和120nmTi四种材料与MSCs细胞复合培养24h后,用FITC-Phalloidin对细胞骨架进行染色,并在免疫荧光下观察细胞骨架、测量细胞的长、短轴,利用长/短轴的比值来分析细胞黏附在四种材料表面上的形态；4种材料与MSCs细胞复合培养14d后,采用PCR法测量材料表面成骨相关基因表达量(OCN、OPN、ALP、RUNX2和COL-1)。6,将Ti及100nmTi两种植入材料,植入新西兰大白兔子体内,术后4、12周耳静脉空气注入处死大白兔,切成只剩余有植入物的小段,在内固定系统中干燥存放,进行Micro-CT断层扫描,观察植入材料-骨界面的结合程度；选择术后4、12周两个时间点进行材料与骨界面的破坏载荷测试材料-骨界面的结合强度；将骨组织固定、包埋、组织切片后,进行Masson染色,在显微镜下观察并采集图像,分析材料-骨界面的成骨效果。7,统计学处理：所有数据均采用“均数±标准差”表示,应用SPSS13.0进行统计学分析。各组间数据应用析因设计方差分析、One-WayANOVA进行统计学分析,两两比较采用LSD法。方差不齐时,采用DunnettsT3比较。α=0.05,P<0.05认为差异有统计学意义。结果1.材料表面形态及表征1.1SEM观察材料表面SEM结果显示钝钛基片在1.45wt%NH4F和1.93wt%H2C2O4混合电解液中制备钛纳米棒,采取直接加电流法,调节到200mA后带电放入电解液中,分别反应20min,30min,40min分别制备出平均长度为30nm,100nm,120nm的纳米棒结构。1.2材料表面能谱分析能谱分析结果显示了钛基片和钛基纳米棒表面元素组成及元素的比例,结果提示钛基片和钛基纳米棒表面组成一样,都是100%Ti元素。1.3AFM观察材料表面AFM观察各组材料表面并测量各个样品的粗糙度,对照组Ti的粗糙度最低,随着纳米棒的长度增加,粗糙度越大。4种表面的粗糙度分别是：7.76±1.49nm,9.51±1.26nm,13.45±1.49nmand19.06±4.19nm。1.4早期蛋白黏附材料的早期蛋白黏附结果显示四种材料的早期蛋白黏附无统计学差异。2.钛基纳米棒的生物相容性研究2.1LDH细胞毒性检测不同材料试样与L929细胞复合培养24h后,各组间细胞培养液的LDH活性无明显差异,说明对照钛和钛纳米棒均无细胞毒性。2.2MTT法检测细胞增殖率MTT法检测细胞增殖率结果显示Ti、30nmTi、100nmTi及120nmTi四种材料的细胞毒性分级均为0或1级,表明四种材料稳定,均无细胞毒性,为合格的生物材料。2.3Calcein-AM/EthD-1死活染色法Calcein-AM/EthD-1死活染色结果显示4种材料表面培养的L929细胞活性好,大部分为绿染色,表明四种材料均无明显的细胞毒性,为合格的生物材料。3.不同长度的钛基纳米棒对骨髓间充质干细胞的生物行为的影响3.1SEM观察细胞黏附形态细胞与材料共培养24h后,可见细胞与各组材料的黏附好,高倍镜下,可见到细胞在对照组的钛表面上贴壁展开,细胞扁平,细胞之间接触良好；而在纳米表面上的细胞呈梭形,其中100nmTi表面的细胞最为狭长(长／宽比最大)。四种材料的长／宽比：100nmTi>30nmTi>120nmTi>Ti。3.2DAPI早期细胞黏附MSCs在不同表面上30min,60min及120min的黏附结果表明：四组材料与细胞复合培养30min后,100nmTi和120nmTi表面的细胞黏附明显高于对照组(P<0.05),120nmTi与对照组无统计学意义(P>0.05),其中100nmTi表面黏附的细胞最多；复合培养60min后,各组材料表面黏附的细胞明显较30min多,3组纳米表面黏附的细胞均较对照组多,有统计学意义(P<0.05),100nmTi>30nmTi>120nmTi>Ti。复合培养120min后,各组材料表面黏附的细胞明显较30min和60min多,100nmTi和120nmTi两组纳米表面黏附的细胞均较对照组多,有统计学意义(P<0.05),120nmTi与对照组无统计学差异,100nmTi>30nmTi>120nmTi>Ti。3.3MTT细胞增殖活力检测Ti,30nmTi,100nmTi和120nmTi四种表面复合培养MSCs细胞,比较1d,3d和5d各组材料表面的细胞增殖活力。结果表明：各组材料的细胞生殖活力有显著性差异(P<0.01)；每组材料的OD值随着时间而增加,符合细胞的生长曲线；每组材料在不同时间点的细胞增殖活力有显著性差异(各组P值均<0.01)。相同的时间点,不同的材料也有统计学差异(1D：P=0.013；3D：P=0.000；5D：P=0.000；P值均<0.05)；纳米表面均比对照钛OD值高,表明钛基纳米棒表面的增殖活力高于对照钛表面。细胞培养1天后,纳米表面的OD值均高于对照钛,但与对照钛相比无统计学意义；培养3天后,纳米表面的OD同样高于对照钛,且100nmTi和120nmTi的OD值与对照钛相比有统计学差意义(P<0,05)；培养5天后,各组纳米表面的OD值仍然高于对照钛,均有统计学意义(P<0.05),表明纳米表面的增殖活力均较对照钛强。其中100nmTi表面的细胞增殖活力最强,与任一组材料比较均有统计学差异(P<0.05),表明100nmTi的细胞增殖活力最强。总体来说,100nmTi的细胞增殖活力最大,其次是120nmTi,接着是30nmTi,对照钛的细胞增殖活力最小。3.4ALP活性检测ALP检测结果显示,培养14天后MSCs细胞在100nmTi表面的ALP活性高于对照组Ti表面,且有统计学意义(P<0.05)。30nmTi和120nmTi表面与对照组Ti表面无统计学差异。(P>0.05)。四种ALP活性的比较：100nmTi>30nmTi>120nmTi>Ti.3.5矿化结节茜素红染色茜素红染色法检测MSCs细胞在不同材料表面上培养21后的矿化程度。从图中可以发现100nmTi矿化程度最高,与对照组有统计学意义。而30nmTi和120nmTi与对照组相比,无统计学意义。表明100nmTi表面可促进MSCs细胞矿化。4.钛基纳米棒促MSCs成骨分化机制的初步探讨4.1免疫荧光观察胞骨架和细胞形态免疫荧光常用于观察细胞-材料表面接触,分析细胞黏附,形态以及细胞内结构,比如细胞骨架。通过测量经过细胞核中心的细胞长轴和短轴,计算长／宽比值,研究细胞形态的变化。结果发现在对照Ti组上的细胞铺展良好,细胞骨架清晰可见,细胞相互之间有接触。细胞在30nmTi和100nmTi表面的长／宽比值明显比对照Ti组大,有统计学差异(P<0.05),表明细胞形状更为瘦长。但是细胞在120nmTi表面铺展状态最差,提示120nmTi可能抑制细胞铺展。细胞在4组材料表面上的长／宽比从大到小分别是：100nmTi>30nmTi>120nmTi>Ti。4.2PCR检测成骨相关基因PCR检测MSCs细胞复合4种材料培养14天后材料表面的基因表达,结果发现100nmTi表面可显著提高ALP,OCN和OPN的基因表达；4种材料表面的RUNX2和COL-1基因表达无统计学差异。5.钛纳米棒的动物植入实验5.1材料植入实验用兔子体内后,所有兔子术后活动及进食正常,术后创口愈合良好,未出现伤口感染及炎症反应。在预定的时间点进行取材,材料植入区域未见组织坏死、化脓等。5.2Micro-CT检测Micro-CT图像观察Ti和100nmTi植入兔子体内4、12周后材料-骨界面的结合程度。Ti植入4周后,材料与骨界面之间可见缝隙；12周后骨-材料界面的结合程度较术后4周明显改善。100nmTi植入后4周,材料与骨界面结合明显较Ti好；12周后骨-材料界面的结合紧密,未见缝隙。5.3生物力学测试Ti和100nmTi植入兔子体内4、12周后生物力学测试,材料与骨接触面的破坏载荷。结果表明：Ti和100nmTi植入动物体内4周后,两组间的破坏载荷有明显差异(P<0.05),100nm组明显大于Ti组,表明100nmTi与骨接触较好,材料-骨界面新骨形成。植入12周后,两组材料的破坏载荷均较4周明显提升(P<0.05),但100nmTi表面的破坏载荷仍明显高于对照组(P<0.05),说明100nmTi表面可促进细胞黏附、增殖及成骨分化,可促进骨生长,提高骨融合率,更有利于材料-骨界面的骨整合,提高骨-材料界面的强度。5.4Masson染色Ti植入骨4,8周后,可见材料周围大量红染,为成熟骨质,材料-骨界面无新骨形成,材料-骨界面间存在明显间隙。而100nmTi植入4周后,可以现红蓝相间的组织,有少量Ⅰ型胶原产生。植入8周后,材料-骨界面紧贴,界面间可间蓝色新生骨,表明100nmTi有促成骨作用。结论1.本研究应用简单的工艺流程,无需模版,以1.45wt%NH4F和1.93wt%H2C2O4的混合液为电解液,在室温、恒流模式下阳极氧化反应成功制备出Ti纳米棒阵列；反应20min,30min和40min制备出30nm,100nm和120nm的Ti钛基纳米棒；AFM显示各组材料的粗糙度随着纳米棒长度增长而增加,但各组材料的早期蛋白黏附未见明显异常。2.采用乳酸脱氢酶法、MTT比色法以及钙黄绿素细胞死活染色法,分别从细胞培养液、细胞增殖以及直观观察三种不同角度、不同方法来观察四种不同材料的细胞毒性。三种方法相互印证,表明了本研究采用的钛以及其表面改性的纳米棒结构均无细胞毒性,是合格的生物材料。3.电镜下可见细胞与各组材料的黏附好,100nmTi的细胞形态最为狭长；DAPI早期细胞黏附结果发现纳米表面均比对照组细胞黏附多,其中100nmTi的早期细胞黏附最多；MTT细胞增殖活力表明纳米表面可明显促进MSCs细胞增殖,其中100nmTi在每个时间点的细胞数量都是最多的；ALP活性检测表明100nmTi表面可促进MSCs细胞成骨分化；茜素红染色法检测结果表明100nmTi表面可促进MSCs细胞矿化。4.细胞在30nmTi和100nmTi表面的长/宽比值明显比对照Ti组大,细胞形状更为瘦长,细胞在4组材料表面上的长/宽比从大到小分别是：100nmTi>30nmTi>120nmTi>Ti;PCR检测4组材料表面的成骨基因表达,结果发现100nmTi表面可显著提高ALP,OCN和OPN的基因表达。5.Micro-CT横断扫描结果显示100nmTi骨-材料界面的结合紧密程度均较Ti好；100nmTi表面的破坏载荷均明显高于对照组,表明100nmTi可促进骨生长,提高骨融合率,提高骨-材料界面的强度；Masson三色染色结果表明,100nmTi界面间可间蓝色新生骨,表明100nmTi有促成骨作用。本文通过系列实验研究,在钛表面成功构建了长度的纳米棒阵列,利用纳米形貌修饰的钛表面可影响间充质干细胞成骨分化功能,促进钛-骨界面的骨愈合,为钛植入物表面纳米化形貌修饰的临床应用提供了实验基础。
【作者】林曦；
【导师】尹庆水；
【作者基本信息】南方医科大学，骨外科学，2014，博士
【关键词】纳米结构；纳米棒；钛；成骨；

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