促性腺激素释放激素激动剂治疗子宫内异位症患者在位内膜的蛋白质组学研究
【摘要】子宫内膜异位症(简称内异症,Endomctriosis,EMS)是指具有生物学活性的子宫内膜种植在子宫腔以外的组织中,主要临床症状表现为痛经、不孕、慢性盆腔痛及性交痛等,是育龄期妇女常见病、多发病之一。据报道其发病率高达3%～10%,且近年来有明显增高的趋势,其中30%-50%的内异症患者伴发不孕,30%-58%的不孕症患者合并内异症,因而内异症对患者的身心健康及生活质量有很大影响。此疾病虽是一种良性疾病,但却具有转移、种植等恶性行为。内异症的发病机理尚未研究清楚,但多项研究表明与正常妇女相比内异症患者血清、腹腔液中多种生化分子的表达均增高,如癌抗原CA-125、CA19-9、抗子宫内膜抗体以及某些细胞因子等,同时内异症患者的在位子宫内膜生化特性也发生了改变。目前子宫内膜异位症诊断的金标准是腹腔镜检查结合病理学诊断,但可以代替腹腔镜作为内异症诊断的简单、无创的金标准仍缺乏,临床有将上述表达变化的生物学分子用作辅助诊断手段,但它们的敏感性和特异性不高,而且诊断界值尚未确定,故仅具有临床参考价值。目前,治疗方法有药物治疗、手术治疗以及辅助生育等,其中药物治疗分为：性激素治疗、中药治疗及其他治疗；手术治疗分为腹腔镜下手术和开腹手术。手术方式包括：保守性手术即保留生育功能手术,半根治性手术即保留卵巢功能手术,根治性手术即全子宫切除与双侧附件切除术及病灶切除。尽管目前有各种治疗方法与措施,但均未真正起到根治的作用,也未取得长久消除症状的效果。子宫内膜异位症经典的治疗模式为腹腔镜手术+药物治疗。经典的药物主要是GnRHa、口服避孕药、丹那唑、孕三烯酮等。它们疗效确切,但是停止治疗后数月往往复发。其中应用较广的是GnRHa,在疾病治疗方面,缩小病灶、延缓复发、减轻盆腔疼痛等疗效明显,但药理作用机制仍然不明确。近年来,虽然有较多的研究对子宫内膜异位症的发病机制进行了报道,但是确切的机制我们仍不清楚。子宫内膜异位症的发病机制,目前尚未完全明确。其可能的发病机制是子宫内膜随经血逆流进入盆腔,在某些因素的作用下,机体不能清除逆流进入盆腔的子宫内膜,异位内膜则在其种植、生长和转移,其中必须通过粘附、侵袭、血管形成三个步骤来完成。目前发现如下几种重要分子可能与发病有关：包括基质金属蛋白酶MMP、调亡抑制蛋白IAP家族成员的Survivin、血管内皮生长因子VEGF等。它们的相互作用引起子宫内膜在盆腹腔内生长、发展,但具体的机制并不清楚。这也阻碍了我们制定更具针对性的治疗子宫内膜异位症的有效方案。因此,继续深入研究GnRHa;对治疗子宫内膜异位症有效的机制具有重要意义,不仅可从侧面了解内异症的致病机理,而且可以帮助我们探索寻找更有效的靶向治疗药物。目前,国内外有GnRHa与蛋白质组学方面的研究,但是尚无GnRHa治疗前后在位内膜在差异蛋白质研究。随着人类基因组学研究的逐渐完成,生命科学的探索已经进入了后基因组时代,即蛋白质组时代。蛋白质组学研究方法有很多种,与传统的研究手段相对,这些方法具有高通量、高效率、高准确性等特点,目前已经被广泛应用于多方面的研究。应用蛋白质组学的研究方法对内异症患者的血清以及在位子宫内膜组织的蛋白质表达变化进行研究,以寻找与内异症发生、发展相关的蛋白质,这将有助于内异症的诊断以及复发的预测。双向凝胶电泳技术(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)于1975年首先由O’Farrell等创立,其原理是在相互垂直的两个方向上,分别基于蛋白质不同的等电点和分子量,运用等电聚焦电泳(isoelectricfocusing,IEF)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)把复杂的蛋白质成分分离。该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物,构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱“,分析特定条件下蛋白质的表达状况,进行蛋白质组差异比较。由于2-DE利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质对其进行分离,因此分辨率非常高,一般能分辨到1000-3000个蛋白质样点。最好的胶可分离得到11000个左右的蛋白质样点。但这与庞大的蛋白质组组分相比远远不能满足需要,因此,样品的制备和发展预分离方法是很有用的。然而,目前该技术仍是蛋白质组研究的核心技术。二维电泳分离后的蛋白质经染色后显示进行鉴定,二维电泳中的显色是一个重要步骤,常用的显色方法有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或同位素标记等。传统的染色方法银染和考马斯亮蓝法染色,二者均有一定的弊端。银染的线性范围较窄,重复性差,考马斯亮蓝法染色灵敏度较低。最近研究发现荧光染色法,其灵敏度与银染相似,但速度更快,线性范围更宽,同时减少了对质谱鉴定的影响。四种常用方法比较,银染法是非放射性染色方法中最灵敏的,其灵敏度可达到lng甚至更低。但是灵敏的还是利用同位素标记,20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。图像分析也是二维电泳研究的重要方面。染色后可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定仪等建立双向凝胶电泳图谱。此外,还要对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较,除掉凝胶图谱的纹理和背景,找到表达上差异的蛋白质点,确定有生物意义的蛋白质。差异凝胶电泳(differentialin-gelelectrophoresis,DIGE)用来检测蛋白质在两种样品中表达情况。对两种样品中的蛋白质采用不同荧光标记后混合,进行双向凝胶电泳,用荧光显微镜观察,如果同一斑点显示两种荧光,说明一种蛋白质同时在两个样品中表达；如果一个斑点只显示一种荧光,该蛋白质只在相应的样品中表达。差异凝胶电泳技术是双向电泳技术的新发展,它最大的优点是通过在同一块凝胶上电泳,完全排除了由于电泳的重复性问题可能导致的误差,大大提高了结果的可信度。可以用此种技术对不同样品蛋白质表达差异进行分析,如对来自正常组织和癌变组织的样品蛋白质表达差异进行分析。但是该项技术还是有一定弊端的,如该方法是将荧光染料标记在赖氨酸残基上的,对于不含赖氨酸的蛋白质则难以使用,同时该方法所用的仪器及试剂较昂贵,较难以普遍使用。2-DDIGE是在双向电泳技术的基础上引入了荧光标记和内标,通过与荧光染料高度匹配的荧光成像仪获取三通道信号,以消除凝胶之间差异,从而检测样品间的蛋白质组表达差异。2-DDIGE是一种高通量的蛋白质组学研究技术,因此我们课题采用2-DDIGE对子宫内膜异位症患者在GnRHa治疗前后在位内膜细胞进行蛋白质差异研究。以期从中筛选到与子宫内膜异位症发生密切相关的蛋白并明确其作用机制,为阐明子宫内膜异位症的发病机制提供实验依据。研究目的：分析GnRHa治疗前后子宫内膜异位症患者在位内膜蛋白表达的差异,分析其发生的原因并揭示相关发生机制,为阐明子宫内膜异位症的发病机制提供实验依据。研究方法：本研究采集了GnRHa治疗前后子宫内膜异位症患者的在位内膜组织,采用了TUNEL染色法和Westernblot检测组织内细胞凋亡情况；用2-DDIGE检测GnRHa治疗前后子宫内膜异位症患者的在位内膜组织内差异蛋白的表达情况,筛选有意义的蛋白,并应用Westernblot和免疫组织化学技术对他们的表达水平进行验证；从子宫内膜异位症患者在位内膜活检组织中原代分离培养子宫内膜上皮细胞,TUNEL染色法和Westernblot检测GnRHa对培养细胞凋亡的诱导作用,并检测GRP78的表达量；干扰和过表达GRP78的表达量检测在位内膜上皮细胞的凋亡率。研究结果：1.GnRHa治疗诱导在位内膜上皮细胞凋亡取GnRHa治疗前后病人在位内膜组织样本,提取总蛋白后,用Westernblot检测caspase3的蛋白表达量。结果显示,使用GnRHa后,caspase3表达量升高。相同组织标本进行石蜡切片后,TUNEL和Hoechst共标记检测组织原位凋亡情况。结果显示,使用GnRHa后,子宫内膜异位症病人在位内膜组织凋亡细胞增加。以上结果说明,使用GnRHa可诱导子宫内膜异位症患者在位内膜上皮细胞的凋亡。2.子宫内膜异位症病人GnRHa治疗前后在位内膜蛋白差异表达的研究取GnRHa治疗前后病人的在位内膜组织样本,应用2-DDIGE对组织蛋白的差异表达情况进行研究。结果发现55个差异表达的蛋白,其中26个蛋白经过MALDI-TOF/TOFMS鉴定,包括12个上调蛋白和14个下调蛋白。按功能可分为,6个分泌蛋白、4个细胞骨架蛋白、4个分子伴侣、4个蛋白具有催化活性、2个蛋白参与氧化还原反应、2个是细胞膜蛋白和其他蛋白。应用Westernblot和免疫组化验证由2-DDIGE筛选出的四个GnRHa治疗前后子宫内膜异位症病人在位内膜组织中差异蛋白的表达。这四个蛋白是：GRP78、PPA1、EFHA2和TGM2。GAPDH作为内参,Westernblot检测子宫内膜异位症病人在位内膜组织中GRP78、PPA1、EFHA2和TGM2的蛋白水平。结果显示GRP78和PPA1在子宫内膜异位症患者治疗后下调,而EFHA2和TGM2则上调。用免疫组织化学法检测子宫内膜异位症病人在位内膜组织切片中GRP78、PPA1EFHA2和TGM2的表达,结果与Westernblot检测结果相同。GRP78和PPA1在子宫内膜异位症患者治疗后下调,而EFHA2和TGM2则上调。3.GnRHa诱导体外分离的子宫内膜上皮细胞凋亡检测原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞,TUNEL和Westernblot检测caspase3在醋酸亮丙瑞林处理后细胞凋亡检测。结果显示,原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞经醋酸亮丙瑞林处理后,TUNEL染色阳性细胞增加。Westernblot检测醋酸亮丙瑞林处理的原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞caspase3表达量,显示处理后caspase升高。提示,GnRHa可以诱导原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞发生凋亡。4.GRP78对GnRHa处理后在位内膜上皮细胞凋亡的影响Westernblot检测GnRHa对原代分离培养来自子宫内膜异位症病人在位内膜上皮细胞的GRP78表达情况。结果显示,GnRHa;对子宫内膜上皮细胞的GRP78有下调作用,说明GRP78参与GnRHa诱导在位内膜上皮细胞凋亡的负调控。应用siRNA干扰原代培养的在位内膜上皮细胞表达GRP78,再用醋酸亮丙瑞林处理后,细胞凋亡率增加；构建GRP78过表达载体,再用醋酸亮丙瑞林处理后细胞凋亡率减低。从正反面进一步验证了GRP78参与GnRHa;对子宫内膜异位症病人在位内膜上皮细胞凋亡的负调节反应。结论：(1)子宫内膜异位症患者GnRHa治疗后可诱导在位内膜上皮细胞的凋亡；(2)2-DDIGE检测子宫内膜异位症病人GnRHa治疗前后在位内膜的差异蛋白表达并进行验证,结果有55个差异表达的蛋白,其中GRP78和PPAl在子宫内膜异位症患者治疗后下调,而EFHA2和TGM2则上调；(3)GnRHa可以诱导原代分离培养的来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞的凋亡；(4)对GRP78调节患者GnRHa治疗后诱导在位内膜上皮细胞凋亡的作用进行研究,发现GRP78可以负向调控GnRHa诱导的在位内膜上皮细胞的凋亡。
【作者】翁慧男；
【导师】王沂峰；
【作者基本信息】南方医科大学，妇科肿瘤，2014，博士
【关键词】子宫内膜异位症；GnRHa；在位内膜；上皮细胞；凋亡；
【参考文献】
[1]刘源.ZX银行信用卡营销战略研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[2]楚先锋.中国住房商品化时期的城市住宅设计观念及发展趋势探讨[D].清华大学,建筑与土木工程,2002,硕士.
[3]艾雷.基于改进的Beam-Search方法的手写中文地址识别[D].华东师范大学,系统分析与集成,2013,硕士.
[4]刘洪丽.主述位之理论在翻译中的应用[D].四川外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[5]刘梦珂.郑州市“城中村”问题研究[D].华中师范大学,农村与区域经济发展,2014,硕士.
[6]肖婷婷.网络名誉权的法律保护研究[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[7]李小佳.我国旅游业导游薪酬研究与设计[D].北京交通大学,2009.
[8]胡国锋.基于特征对比度的视觉注意和贝叶斯网络的林区火焰智能检测技术研究[D].杭州电子科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[9]沈睿彧.J证券公司经纪业务竞争策略研究[D].哈尔滨理工大学,工商管理,2012,硕士.
[10]陈恒.小灵通长春地区销售渠道研究[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[11]唐明珠,阳春华,桂卫华,谢永芳.代价敏感概率神经网络及其在故障诊断中的应用[J].控制与决策,2010,07:1074-1078.
[12]孟庆志.无人机在水环境监测中的航迹规划研究[D].浙江大学,系统工程,2012,硕士.
[13]晁贯良.两栖仿生机器鱼设计及其复杂异型件的加工[D].石河子大学,机械制造及其自动化,2012,硕士.
[14]赵云霞.我国东部地区外商直接投资环境效应分析[D].山东财经大学,国际贸易学,2014,硕士.
[15]杨丹.网络教育支撑平台中多媒体课件开发工具的研究与实现[D].重庆大学,计算机系统结构,2003,硕士.
[16]王军,伍水生,赵文波,廉培超,王亚明.石墨烯基纳米材料吸附水溶液中离子研究进展[J].化工新型材料,2013,12:25-27.
[17]李聪.从福柯的话语、权力观看其文学指向[D].西安外国语大学,比较文学与世界文学,2014,硕士.
[18]胡轩升.激光诱导击穿光谱应用于硅片中金属元素的扩散分析[D].杭州电子科技大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[19]毛小明.司法实践中的缔约过失责任制度研究[D].上海交通大学,法律,2013,硕士.
[20]刘莹.正常重力校正基准研究[D].长安大学,地球探测与信息技术,2013,硕士.
[21]黄根成.hsp65-、rpoB-PCR-RFLP用于非结核分枝杆菌菌种鉴定的研究[D].扬州大学,遗传学,2012,硕士.
[22]张亚飞.基于SBISP的易扰动土变形机理研究[D].中国地质大学,地质工程,2014,博士.
[23]周旋.猪圆环病毒2型Rep蛋白的ATP酶和解旋酶活性的研究[D].华中农业大学,预防兽医学,2014,硕士.
[24]郭凯凯.资本结构对高管薪酬业绩敏感度的影响研究[D].浙江财经学院,会计学,2013,硕士.
[25]陈妍林.自噬和Rab9在APPswe/PS1dE9双转基因小鼠神经元变性中的作用[D].华中科技大学,神经病学,2013,硕士.
[26]蒋孟洋.p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信号通路在脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受中的作用[D].河北医科大学,病理学与病理生理学,2014,硕士.
[27]房伟,刘培健.SDH网络规划中业务流量的分析及计算方法[J].现代电信科技.1995(06)
[28]代欣欣.基于需求层次的农民工社会保障对其消费行为的影响研究[D].华中农业大学,企业管理,2014,硕士.
[29]韩海涛.碳基纳米复合材料的制备、表征及其在化学修饰电极中的应用研究[D].烟台大学,2014.
[30]邵威.含可断裂键聚合物的合成及其性能研究[D].苏州大学,应用化学,2013,硕士.
[31]陈莎.地方行政程序中的主体研究[D].湖南师范大学,法学理论,2014,硕士.
[32]程亦男.关于非语言信息在中日口译过程中应用的实践报告[D].广东外语外贸大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[33]李景鱼.交互式电子双板及其在中学课堂教学中的应用研究[D].华中师范大学,教育技术学,2014,硕士.
[34]叶巧选.复杂理论视角下的学校发展[D].河北师范大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[35]汪洲.光学电流传感器的可靠性研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[36]贾伟.制动器温升与山区道路参数及车辆工况关系研究[D].重庆交通大学,载运工具运用工程,2012,硕士.
[37]周平良.当代青年大学生红色信仰教育有效途径的探讨[D].江西农业大学,思想政治教育,2012,硕士.
[38]陈世永.关于现阶段我国教育机会均等问题的研究[D].安徽大学,社会学,2004,硕士.
[39]徐杰.大型体育赛事物流方案设计与研究[D].西南交通大学,物流工程,2013,硕士.
[40]陈丹.基于着色Petri网的科研工作流系统的研究与应用[D].广东工业大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[41]龚炳铮.国际自控联(IFAC)第十一届世界大会[J].自动化学报,1991,01:121.
[42]安秀芳.基于平衡计分卡下中国民生银行的绩效管理研究[D].山西财经大学,会计学,2014,硕士.
[43]陈虎.会计流程再造的集成网络财务系统研究[D].南京理工大学,2005.
[44]孙红雨.闭路光折变聚合物空间孤子动态行为的研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2014,硕士.
[45]冯丽,邱家驹.粗糙集理论在短期电力负荷预测中的应用[J].华北电力技术,2004,04:5-7+38.
[46]马巧丽.CARTO系统引导环肺静脉射频导管消融阵发性心房颤动：单中心经验[D].大连医科大学,内科学,2012,硕士.
[47]强保华.异构数据库语义集成技术研究[D].重庆大学,2005.
[48]何菲.上海市嘉定区JDM项目定位研究[D].西南交通大学,工业工程,2012,硕士.
[49]尹立杰.宋代仕女形象笔墨技法分析[D].吉林艺术学院,国画,2012,硕士.
[50]史春涛,孙立星,刘建军,郝鑫瑞.内燃机喷雾模型的研究现状[J].农业机械学报.2007(02)
