勒福特王水消解法检验硅藻的法医学应用研究

【摘要】研究背景：水中尸体是法医学尸体检验中常见的类型。我国水网密集,水中尸体检验检验量很大,每年仅在广州地区发现的水中尸体就近千具。在水中发现的尸体绝大多数属于意外溺水死亡,但也可能为自杀或他杀,也不排除死后抛尸入水伪造意外溺水身亡。判断溺死或是死后入水是案件定性的关键。溺死的机制是大脑不可逆的缺氧,由于大量溺液被吸入到呼吸道及肺泡,阻碍气体交换,导致低氧血症和二氧化碳潴留,发生窒息死亡。对于新鲜的水中尸体,可以通过案情及口鼻部蕈样泡沫、水性肺气肿、呼吸道内泥沙等溺死的典型征象进行溺死鉴定。珠江水域地处亚热带气候,天气炎热,根据统计,87%的水中尸体在发现的时候已经高度腐败,对于水中高度腐败尸体的死因诊断,由于各种溺死征象已不复存在而成为世界公认的法医学难题之一。硅藻是一种单细胞藻类,全世界约有16000多种,体长一般在1μm至200μm之间,其最明显的特征是细胞壁除个别种类外,均高度硅质化,形成上、下两个透明的壳,以壳环带套合形成一个硅质细胞壁。硅藻的生活环境非常广泛,地球上凡是有水滞留的地方,几乎都能见到硅藻的踪迹。硅藻细胞壁因为抵抗力强而不易被破坏,硅质含量高者,即使用浓硫酸、浓硝酸煮沸甚至高温烧灼也难以破坏。尸体腐败时对检材组织进行消化处理也能保持其原形,这一特征非常有利于溺死诊断。自Revenstorf在1904年从肺切面液体中直接观察到硅藻后,国内外法医学工作者对硅藻检验进行了广泛的研究,在尸体内脏组织(肝、肾、骨髓)中检出硅藻被认为是明确溺死最有力的指标。通过硅藻检验对硅藻进行定性定量分析,不仅可以直接判断死因,而且对尸体和溺死可疑地点的水样种类及数量比对分析,还有助于推断溺死地点。目前法医学硅藻检验的方法很多,其主要包括样本提取及消解方法、硅藻富集方法、硅藻观察方法三个基本步骤,近百年来,硅藻检验诊断溺死研究,集中在这三个环节,其中样本提取及消解是法医学硅藻检验成功与否的首要环节和重要步骤。样本提取及消解方法1937年,Kasparek首先采用浓硝酸消解肺组织,奠定了强酸消解法的基础。在以后的法医学实践中,又发展了硝酸沙浴法、硝酸硫酸法、硝酸硫酸加过氧化氢法、硫酸加硫酸铜法和硝酸乙醇法等。但强酸消解法消解组织过程中存在工作强度高；消解时间长；反应过程剧烈,存在硝酸喷出灼伤人体的危险,所释放的二氧化氮污染环境；部分硅藻在消解过程中被破坏等缺点。Hiroshi等采用Soluene-350(助溶剂)消化组织,该法较强酸消解法节省时间,工作简单,但消化能力差,试剂来源也困难,基本不适合在法医实践中的应用。此外,还有酶消解法、微波消解法及硅胶梯度法等,但这些方法均存在消解时间长、消化能力差、消解组织量少等缺点。硅藻的富集方法离心是目前全世界法医学实验室普遍采用的硅藻富集方法。我国的人体组织器官硅藻硝酸破机法检验标准中采用4000r/min离心15min,用吸管吸去上清液,再加重蒸水平衡后离心,重复上述步骤直至上清液酸碱度在6.5-7.5间。本项目课题组赵建等研究发现4000r/min离心15min一次硅藻损失在29.94%至49.60%之间,大量的硅藻存在于被弃去的上清液中。硅藻的观察方法目前国内外法医学实验室绝大多数采用光学显微镜检测脏器组织内的硅藻,一些微型硅藻容易被漏检或受放大倍数限制无法根据硅藻表面纹饰鉴别其种属。另外,有学者认为,文献中不同研究人员报道的硅藻检验数据相差较大,可能因为所采用的光学显微镜放大倍数不同。因此光学显微镜检测法的准确性,尤其是分类的准确性有待进一步考证。Torre等和Pachar等相继报道了采用传统强酸消解与扫描电镜检测的硅藻检验方法,与光学显微镜相比,扫描电镜具有放大倍数高及景深大的优势,可观察硅藻的细微结构,而且容易实现图像存储,便于硅藻学家根据硅藻图像准确鉴定种属。由于现有硅藻检验方法的种种限制,造成硅藻检验在法医学水中尸体死因鉴定中不能完全发挥其应有的作用。而且由于硅藻检验缺乏统一规范的标准,争议较多,检材常涉及腐败组织,检验难度大,阳性率低,其次样品处理过程复杂,容易污染,操作环境恶劣,对操作者健康有害,法医学工作者一直在探讨快速、有效、准确,易于推广的新方法、新技术的研究。目的：1、建立准确、高效的硅藻检验技术；2、建立广东省珠江水域的硅藻扫描电镜图谱库,为广东法医工作者进行硅藻种类识别和落水地点推断提供科学的比对参考依据。1.季节影响.种类方法：(一)勒福特王水消解法的建立1、22只新西兰大白兔随机分为动物随机分为勒福特王水消解组10只,传统强酸消解组10只,空白对照组2只。取干净的剪刀剪取约2g肾组织,放入1OOml烧杯中剪碎。2、加入15ml浓硝酸和5ml浓盐酸；2ml过氧化氢以1滴/3秒的速度逐渐滴入烧杯中；然后静置15Mmin；3、将样本放入85℃水浴锅中加热50min(加热过程中同样以1滴/3秒的速度加入3ml过氧化氢溶液)；4、传统强酸消解法步骤：1)加入2ml水样；2)向烧杯中加入20m1分析纯浓硝酸和5ml过氧化氢；3)将样本放入85℃水浴锅中加热50min。5、真空抽滤,扫描电镜观察；6、比较两种方法的硅藻回收率、硅藻破坏和消解能力,并采用SPSS17.0进行统计学分析,计量资料采用两独立样本t检验分析、计数资料采用卡方检验分析,P<0.05为有统计学意义。(二)勒福特王水消解法检验动物器官硅藻1、44只新西兰大白兔随机分为生前入水组20只(勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法：10只；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法：10只),死后入水组20只(勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法：10只；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法：10只),陆地死亡组(对照组)4只。2、动物模型建立：溺死动物模型(将兔笼中沉入水下0.5m,1min后提出水面,30s后重新沉入相同水深处,重复以上步骤直至大白兔死亡,死后在水中浸泡30min)。死后入水组动物模型(采用耳缘静脉空气栓塞法,将死亡的兔子置于相同水域相同深度浸泡30min)。陆地死亡组动物模型(采用耳缘静脉空气栓塞法)。3、分别对实验组和对照组进行实验兔的肝脏、肺脏和肾脏进行检验,比较消解时间、检出率、检出数量和观察效果,并应用SPSS17.0进行统计学分析。(三)勒福特王水消解法检验水样硅藻1、对广东珠江流域19个采样点在2012年6月进行采样,其中包括肇庆市德庆县段等西江支流6个采样点,浈江乐昌县段等北江支流9个采样点以及龙川县段等东江支流4个采样点,其中部分采样点于2012年9月在同样地点也采集了水样。2、勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法检测水样中的硅藻,收集不同种类的硅藻,并将其适当倍数的电镜图像制作成图谱。结果：1、勒福特王水消解法消解肾组织后的物质残留重量为0.00604±0.00310g/2g,传统强酸消解法消解肾组织后的物质残留重量为0.00979±0.00204g/2g,两组数据具有统计学差异(t=-3.072,P<0.01)。2、勒福特王水消解法残留物质较少,硅藻纹理清晰,背景干净,极少发现硅藻碎片。3、硅藻回收率：空白对照样本中未发现硅藻。水样中的硅藻标准含量为711.2个/ml。勒福特王水消解法的硅藻回收率为71.1±10.3%,传统强酸消解法的硅藻回收率为66.3±9.0%。两组数据无统计学差异(t=1.106,P>0.05)。4、勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法分析肺脏、肝脏、肾脏组织中硅藻所用的时间均少于传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法,其分析肺脏、肝脏、肾脏组织所用时间约为传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法的1/4、1/3、1/3。5、勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法和传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法消解肺脏、肝脏、肾脏所用时间为：肺脏<肝脏<肾脏,肺脏组织最容易消解,肝脏组织次之,肾脏组织最难消解。6、陆地死亡组中肺脏、肝脏、肾脏组织均未检出硅藻。生前入水组中,10例样本中,勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法均检出硅藻；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法10例肺脏组织均检出,3例肝脏组织、2例肾脏组织未检出硅藻。两组数据经卡方检验,肝脏组织两种消解方法检出率χ2=3.529,肾脏组织两种消解方法检出率χ2=2.22,两例χ2均小于χ20.05,11=3.84,P>0.05,不能认为两种方法对肝脏(或肺脏)的检出率有差异。死后入水组中,勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法在3例肺脏组织中检出硅藻,传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法在1例肺脏组织中检出硅藻；肝脏、肾脏组织均未检出。7、生前入水组用勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法检出肺脏、肝脏、肾脏组织中的硅藻数量均多于传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法,其在肺脏、肝脏、肾脏组织中检出的硅藻数量约为传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法的10倍、4倍、6倍。死后入水组10例样本中,用勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法有3例检出硅藻,数量分别为12个/g、15个/g、13个/g,数量均少于20；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法有1例检出硅藻,数量为2个/g。8、光学显微镜观察微型硅藻时,以人工方式逐渐移动平台对视野中的硅藻进行观察,样品分析速度慢,硅藻表面纹理不清；扫描电镜观察时,具有自动扫描功能,自动拍摄并存储每个视场图像,样品分析速度加快,而且能观察到硅藻的细微结构。9、广东省珠江水域肇庆市德庆县段、肇庆市区江滨路段、佛山市三水区段等19个采样点共检出21种硅藻(直链藻、卵形藻、小环藻、菱板藻、菱形藻、双菱藻、针杆藻、冠盘藻、舟形藻、曲壳藻、圆筛藻、短缝藻、桥弯藻、海链藻、布纹藻、波缘藻、等片藻、辐节藻、双壁藻、异极藻和羽纹藻),分别属于羽纹纲和中心纲。结论：1、勒福特王水消解法在不降低硅藻回收率的前提下,可显著提高硅藻检验的有机质消解能力,减少消化时间,且消解后滤膜背景杂质少,硅藻表面纹理清晰,容易进行硅藻种属鉴定,具有良好的应用前景。2、建立的特定水体的硅藻扫描电镜图谱库有助于法医检验人员独立完成硅藻种属的比对,利用扫描电镜可获得脏器和水样所含硅藻的高分辨扫描电镜照片,检验人员只需进行简单的形态比较,即可判断两者中的硅藻种类是否一致。对于提高法医硅藻学水平、解决水中尸体溺死诊断难题及落水地点推断具有巨大帮助。
【作者】王会品；
【导师】刘超；
【作者基本信息】南方医科大学，法医学，2014，博士
【关键词】法医硅藻学；溺死；硅藻检验；勒福特王水消解法；扫描电镜；

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