ENO1在胶质瘤中的表达、功能及分子机制初步研究

【摘要】研究背景与目的脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,占中枢神经系统恶性肿瘤的大多数,由神经外胚叶衍化而来的胶质细胞的恶化所产生。临床上通常是依据WHO分级对患者进行治疗并判断其预后。目前标准的治疗方案是在最大范围手术全切除的基础上辅以放射治疗和(或)替莫唑胺等药物化疗。虽然近年来无论是手术切除、放疗亦或药物化疗均取得了进步,也不断有报道证实这些手段的确能延长部分高级别胶质瘤患者的生存时间,但对高级别胶质瘤患者总体预后并无显著改善。并且由于胶质瘤是高度恶性肿瘤呈浸润性生长,与周围正常脑组织无明显分界且易于复发,故目前临床疗效仍不甚理想,许多患者在治疗后的2年内死亡。此外,随着胶质瘤的复发以及复发次数的不断增加,其恶性程度甚至也会不断增加。因此国内外许多学者一直在努力寻找更加有效的治疗胶质瘤的方法。当前神经影像学技术和显微外科技术的不断进步对外科治疗脑胶质瘤的发展起了巨大的促进作用,而分子生物学研究的不断深入,则为肿瘤的基因治疗提供了广阔的前景。但是,目前国内外对脑胶质瘤的治疗至今尚未有突破性的进展。1924年,德国生物化学家OttoHeinriehWarburg第一次描述了细胞的能量代谢途径是怎样在癌变时由三羧酸循环为主转变为有氧糖酵解途径为主从而产生三磷酸腺苷(ATP),这一现象称为Warburgeffect效应。目前人们对于为何肿瘤细胞普遍存在、Varburgeffect效应这个核心问题有多种解释：一是线粒体功能缺失,即]mtDNA突变引起呼吸链功能缺失,导致细胞的氧化磷酸化效率低下；其二,癌症细胞逐渐适应低氧微环境,即细胞中的低氧诱导因子-1alpha(hypoxia-inducedfactor-1alpha,HIF-1α)表达上调,从而导致下游至少70多个靶基因的转录增强；第三,Ras、Src、BCR-ABL等促癌基因的信号转导发生改变；最后,糖酵解通路中的己糖激酶(hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)、乳酸脱氢酶(1actatedehydrogenase,LDH)等关键酶的活性或表达发生改变。因此,许多科研工作者据此认为可以通过干扰肿瘤细胞的糖酵解而切断其能量生成来治疗癌症。目前有多种参与糖酵解的酶有望成为肿瘤治疗的靶点,如烯醇化酶、己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、缩醛酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶以及丙酮酸激酶等等。从肿瘤微环境的角度来讲,尽管胶质瘤的局部血供不足从而导致肿瘤细胞常常处于缺氧的状态,但是胶质瘤细胞却能不停地活跃生长。这当中可能的机制就是葡萄糖摄取能力及有氧氧化能力的增强。近年来的研究表明,部分与糖酵解有关的酶是一种功能复杂的、作用多层面的蛋白,而不是以往所认为的糖酵解途径中简单的一个组成部分[25]。烯醇化酶(Enolase)是糖酵解过程的中的一个关键酶,它能催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。在哺乳动物中存在着三种不同形式的烯醇化酶,即α-烯醇化酶、p-烯醇化酶和γ-烯醇化酶。这三种不同的烯醇化酶由三个不同的基因编码,并且在不同的组织中表达也不相同。α-烯醇化酶,即ENO1,作为糖酵解过程中一个关键的酶,能在许多生理过程中发挥重要的作用。它主要定位于细胞质中,蛋白分子量为48kDa。而在细胞核内存在其同源异构体-c-Myc启动子结合蛋白(c-Mycpromoter-bindingprotein,MBP-1),它起着负性转录调控的作用。大量文献报道,ENO1在许多肿瘤中的转录活性和蛋白表达量均上调。由于ENO1的糖酵解活性与ATP柠檬酸裂合酶的表达上调有关系,因此ENO1可能是一个肿瘤代谢的促进因子,并使得那些ENO1高表达的肿瘤细胞具有生长优势。尽管早期许多研究都认为ENO1能够抑制肿瘤细胞的生长从而发挥抑癌作用,但是近年来的大多数研究均表明ENO1在肿瘤中主要发挥促癌作用。提出ENO1可能具有癌基因功能的多项研究主要集中在非小细胞肺癌、肝癌、甲状腺嗜酸细胞瘤以及黑色素细胞瘤等肿瘤上。Chang[32]等发现ENO1的表达高低与非小细胞肺癌的临床分期以及疾病的复发相关,并且生存分析提示ENO1表达越高,则患者疾病生存期也将明显缩短。Takashima[33]等发现ENO1表达越高,肝癌的恶性程度越高,而且ENO1的表达与肿瘤的大小和血管侵袭程度呈正相关。Baris[34]利用基因表达谱以及Suzukif35]利用2D凝胶电泳分别鉴定了ENO1基因在甲状腺嗜酸细胞瘤和黑色素细胞瘤中的表达均上调。在对ENO1促进肿瘤细胞生长机制的研究中,大多数人认为ENO1在肿瘤细胞生长过程中的能量代谢方面起到了积极的作用,尤其是大多数肿瘤在高代谢情况下,其生长对于糖酵解作用的依赖成为目前研究的重点。而对结肠癌的蛋白组学研究发现,ENO1与细胞分化有关：在增殖较快的肿瘤细胞中,ENO1有相对高水平的表达；而在非增殖的角质化细胞中,ENO1的合成明显减少。由于糖酵解过程的变化与细胞增殖有关,故推测在结肠癌细胞增殖过程中,ENO1的表达可以通过影响糖酵解,三羧酸循环,以及随后的氧化磷酸化酶作用物的水平,进而影响ATP的合成,这对肿瘤细胞的生长十分重要。尽管ENO1在许多肿瘤中均有报道,但是其在脑胶质瘤中的作用则鲜有报道,目前仅一篇文献,并且其在胶质瘤中的具体功能和参与调节的具体信号通路均不明确。为了研究ENO1在胶质瘤中的具体功能,我们首先利用实时荧光定量RT-PCR的方法检测ENO1在胶质瘤组织和正常脑组织中的mRNA水平表达情况,Westernblot和免疫组化检测ENO1蛋白在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达量和定位情况,并分析其表达与病理分级、患者预后之间的关系。随后,采用小RNA干扰技术和慢病毒载体干扰技术,即应用特异性针对ENO1的siRNA干扰片段和shRNA干扰片段,导入胶质瘤细胞的方法来研究其生物学功能改变的情况。在细胞水平比较干扰ENO1表达前后对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移等方面的影响。最后利用Westernblot检测干扰ENO1后,胶质瘤细胞中细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期的相关蛋白表达改变情况,寻找ENO1基因可能介导的信号转导通路,从而使得以ENO1为靶点,干扰胶质瘤细胞糖代谢过程的治疗方法成为可能。研究内容与方法1.胶质瘤临床样本中ENO1表达情况及表达定位的鉴定(1)收集南方医科大学南方医院神经外科收治的136例胶质瘤临床样本及15例正常脑组织。所有临床样本均经过病理确诊,并依据2007年WHO分级对所有样本进行了分级。所有患者均进行了随访；(2)提取45例胶质瘤样本和15例正常脑组织样本的总RNA,经过逆转录成cDNA,以管家基因ARF为内参,运用实时荧光定量PCR检测ENO1的相对表达量;(3)选取10例胶质瘤样本和4例正常脑组织样本,提取组织蛋白,并应用Westernblot技术检测了组织蛋白中ENO1的表达情况；(4)应用免疫组织化学法对136例胶质瘤和15例正常脑组织的ENO1表达进行了定量和定位分析。同时统计分析了ENO1表达情况与临床病理因素。2.ENO1在胶质瘤细胞中的功能研究(1)使用siRNA瞬时干扰U251和U87中ENO1的表达,并用实时荧光定量PCR和Westernblot险验干扰效率。瞬时干扰ENO1表达后,MTT实验检测U251和U87细胞增殖的变化；Boyden和Transwell实验检测U251和U87细胞侵袭和迁移能力的改变；(2)运用慢病毒载体稳定干扰U251和U87中ENO1的表达,并用实时荧光定量PCR和Westernblot检验干扰效率；(3)稳定干扰ENO1表达后,MTT实验及平板克隆形成实验检测U251和U87细胞增殖的变化；Boyder和Transwell实验检测U251和U87细胞侵袭和迁移能力的改变；(4)稳定干扰ENO1表达后,裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤及增殖能力的改变。3.ENO1在胶质瘤细胞中促进细胞增殖、侵袭及迁移的分子机制(1)稳定干扰ENO1表达后,Westernblot检测细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的改变,以及PI3K/Akt通路相关蛋白的变化情况；(2)Ly294002处理U251和U87细胞后,Westernblot检测PI3K/Akt下游相关蛋白的变化。结果1.ENO1在胶质瘤中高表达通过对收集的45例新鲜胶质瘤组织和15例正常脑组织进行实时荧光定量PCR检测,来测定ENO1在胶质瘤和正常脑组织中的表达情况。结果发现,与正常脑组织相比,胶质瘤组织中ENO1mRNA表达水平明显增高(P<0.0001)。此外,Westernblot结果表明,10例胶质瘤组织中ENO1的蛋白表达量较4例正常脑组织高(P<0.0001)。随后运用免疫组织化学技术检测了136例胶质瘤患者和15例正常脑组织中ENO1的表达和定位,结果发现ENO1表达主要位于细胞浆中,并且在胶质瘤中的表达(阳性表达率69.1%,94/136)较正常脑组织(阳性表达率20.0%,3/15)上调(P<0.0001)。2.ENO1在胶质瘤中的表达与病理分级呈正相关经统计分析,ENO1的表达量与患者的年龄、性别和病理类型均无统计学相关,而与病理分级(WHOⅠ-Ⅱvs.WHOⅢ-Ⅳ)呈正相关(P=0.000)。3.瞬时干扰ENO1表达可以抑制细胞增殖、侵袭及转移能力在U251和U87中分别应用3个不同的siRNA片段干扰ENO1的表达,用实时荧光定量PCR检测ENO1mRNA的表达水平来验证干扰效率,筛选出干扰效率最高的片段用于后续实验的开展。实时荧光定量PCR的结果表达,在U251中,siENO1的A片段干扰效率最高(P<0.01)；而在U87中,siENO1的B片段干扰效率最高(P<0.01)。随后应用Westernblot技术检测了蛋白水平的变化,结果和实时荧光定量PCR的结果相符。瞬时干扰ENO1的表达后,采用MTT法对干扰ENO1表达的U251、U87细胞的体外存活能力的变化进行检测。结果表明,将ENO1表达下调后,细胞的增殖能力较对照组相比减弱,生长显著减缓(P<0.001)。随后进行的Boyden体外侵袭实验和Transwell体外迁移实验结果显示,下调ENO1的表达后,U251和U87的穿膜细胞数减少(P<0.05)。这说明ENO1可以促进胶质瘤细胞的侵袭和转移,抑制ENO1后胶质瘤细胞的侵袭和转移明显降低。4.稳定干扰ENO1表达可以抑制细胞增殖、克隆形成和体内成瘤能力在U251和U87中应用3个不同的shRNA慢病毒载体干扰ENO1的表达,用实时荧光定量PCR检测(?)ENO1mRNA的表达水平来验证干扰效率,筛选出干扰效率最高的片段。实时荧光定量PCR的结果表达,shENO1的C片段对U251干扰效率最高(P<0.01),而shENO1的A片段对U87的干扰效率最高(P<0.01)。随后应用Westernblot技术检测了蛋白水平的变化,结果和实时荧光定量PCR的结果相符。保留干扰效率最高的片段,用于后续实验的开展。建立稳定干扰ENO1的U251和U87后,对细胞增殖的变化进行了检测。MTT实验结果表明,稳定干扰ENO1后,U251和U87的生长速度明显较对照组慢(P<0.05)。平板克隆实验的结果显示,干扰ENO1后U251和U87的克隆形成能力明显降低。为了进一步验证这个发现,我们进行了裸鼠皮下成瘤实验。皮下注射稳定干扰ENO1的U251和U87及对照U251和U87后的第18天,将裸鼠处死并取下瘤子称重。注射U251细胞的裸鼠中,干扰组肿瘤的平均重量为0.223g,而对照组的平均重量为0.713g,两者具有显著统计学差异(P<0.01)。注射U87细胞的裸鼠中,干扰组肿瘤的平均重量为0.243g,而对照组的平均重量为0.677g,两者之间亦有显著统计学差异(P<0.01)。最后,应用免疫组织化学技术验证了瘤体中ENO1的表达情况,干扰组的ENO1表达明显较对照组的表达量低。5.ENO1调控了细胞周期和EMT相关基因的表达为了进一步验证ENO1对细胞增殖、侵袭及迁移影响的机制,我们应用Westernblot检测了稳定干扰ENO1的U251和U87细胞中的相关蛋白表达情况。结果显示,干扰ENO1后,可以抑韦(?)p-Rb(Ser780)、NF-κB的激活,以及肿瘤细胞周期相关的CyclinD1和CyclinE1。总Rb和E2F1的表达没有变化。此外,干扰ENO1的表达也可以使Snail、β3-catenin、Vimentin、Slug和N-cadheri下调,而E-cadherin上调。6.ENO1调控PI3K/AKT通路PI3K/AKT作为上游通路,可以调控细胞周期和EMT。通过Westernblot,我们检测了ENO1对PI3K/AKT通路的影响。结果发现,干扰ENO1后,磷酸化PI3K和AKT的表达明显下调,而非磷酸化PI3K和AKT的表达无变化。同时,用PI3K/AKT的抑制剂LY294002处理U251和U87,可使E-cadherin上调,而CyclinD1和p-Rb则下调,这与干扰ENO1的变化相同。这表明ENO1是PI3K/AKT通路上游的调控因子并可调节该通路。结论ENO1在胶质瘤中高表达,表达量与胶质瘤的病理分级呈正相关,且与患者预后呈负相关。ENO1表达情况可以作为胶质瘤患者预后的预测指标。细胞功能学实验表明,ENO1可以促进胶质瘤细胞的增殖、克隆形成和体内成瘤能力,并促进胶质瘤细胞的侵袭和转移。进一步的机制研究表明,ENO1可以通过抑制E-cadherin,而促进Snail、β-cateni、Vimentin和N-cadherin的表达来调控胶质瘤细胞的侵袭及转移。并且可促进p-Rb、NF-κB的激活以及肿瘤细胞周期相关的CyclinD1和CyclinE1的表达,来调节细胞的增殖。此外,ENO1也可能通过PI3K/AKT通路介导胶质瘤细胞的生长、侵袭及转移。
【作者】罗起胜；
【导师】漆松涛；宋烨；
【作者基本信息】南方医科大学，神经外科（专业学位），2014，博士
【关键词】ENO1；胶质瘤；细胞增殖；EMT；PI3/AKT；

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