MIR-124-5P对LAMB1转录后调控作用抑制高级别胶质瘤的生长

【摘要】神经胶质瘤是临床上最常见恶性原发性脑肿瘤,其发病率约占所有颅内原发性脑肿瘤的35.26～60.96%(平均44.69%)。通常,神经胶质瘤中心是一个出血坏死灶,而周围是与正常脑组织边界不清的高致密肿瘤细胞区。神经胶质瘤细胞具有无限增殖能力和很强的侵袭性,很容易向周围正常脑组织进行侵袭。胶质瘤生长迅速且与周围正常脑组织边界不清,呈浸润性生长,因此,神经胶质瘤很难通过外科手术切除手段达到完全病理学肿瘤切除的目的。另外,由于神经胶质瘤对放疗不敏感和对化疗药物容易产生耐药性,也导致了其复发率高和预后差的结果。因而,尽管给予了多种综合治疗手段,神经胶质瘤治疗效果仍不理想,特别是恶性程度高的胶质母细胞瘤(GBM)患者生存期仅有12-15个月。恶性胶质瘤的难治性很大程度就在于其侵袭性强的生物学特性。因此,关于神经胶质瘤侵袭性方面的研究和寻找更为有效的治疗手段非常有必要。通常,肿瘤基本的侵袭过程是瘤细胞从原发瘤灶脱落,侵袭基底膜(BM)和细胞外基质(ECM)相互作用的复杂过程。肿瘤细胞首先黏附于基底膜和血管内皮细胞,然后通过分泌蛋白水解酶和促进血管生成发挥作用。而所有级别的恶性胶质瘤都会发生弥漫性单细胞侵袭。胶质瘤细胞往往沿有髓纤维束和在血管周围间隙沿血管进行迁移。因此,神经胶质瘤这种侵袭特性与基底膜和细胞外基质的组成成分密不可分。多种基底膜和细胞外基质的组成成分已证实了在人胶质瘤中过度表达,如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白、玻连蛋白和腱糖蛋白,这些物质都与胶质瘤细胞的迁移和侵袭有着密切的联系。层粘连蛋白(laminin,LN)是一组细胞外基底膜异源三聚体的糖蛋白大家族,主要由α、β、γ这三种链不同的组合而构成。层粘连蛋白在许多基本的生物过程中发挥着重要作用,包括细胞粘附和迁移、胚胎发育、肿瘤浸润、血管生成、组织分化和伤口愈合等。层粘连蛋白不仅是血管基底膜的主要功能成分,也是细胞外基质的主要功能成分。而且,层粘连蛋白还是正常脑组织微血管BMs的主要组成成分。胶质瘤细胞自身也能合成和分泌多种LN参与血管基底膜和血管基底膜构成,也表达大量的整合素受体。有研究发现在低级别和高级别的胶质瘤及胶质母细胞瘤(GBM)邻近的正常脑组织中过度表达含α4链的LN。一种含α4链的LN亚型层粘连蛋白-8主要是在多形性胶质母细胞瘤和邻近多形性胶质母细胞瘤的脑组织中的血管基底膜上表达,而另一个含α4链的层粘连蛋白-9则主要在低级别胶质瘤和正常组织血管基底膜表达。LN-8是表达于血管内皮细胞的主要亚型。LN-8已被证实与相应的受体整合素结合,对于骨髓功能和血-脑屏障的维持起着十分重要的作用。LN-8还可以通过与整合素α3β1和α6β1的相互作用促进胶质瘤细胞黏附和迁移。过表达LN-8的GBM患者肿瘤复发时间和病人存活期与过表达LN-9的GBM患者相比较都有所缩短。而神经胶质瘤一个显著特征在于血管内皮细胞增殖和显著的肿瘤血管生成,后者是胶质瘤的生长、侵袭和转移过程中的一个重要的基础条件。含α4链层粘连蛋白本身就能促进肿瘤血管生成。以上所诉说明了LN-8在胶质瘤的侵袭和肿瘤血管生成过程中发挥着重要作用,可以促进胶质瘤的复发。随着脑胶质瘤的进展,毛细管基底膜中含有α4链层粘连蛋白的表达会显著上调,并且含有β2链的LN-9(α4β2β1)会被含有β1链的LN-8(α4βγ1)所取代。LN-8和LN-9具有相似的结构,只是其中的β链不同。胶质瘤进展过程中含β2链LN-9转变为含β1链(LAMB1)LN-8潜在的调节因素还尚为人所知。因此,对于LN-8的基因调控机制的研究就显得非常有意义。MicroRNAs新近发现的一类广泛存在于真核生物体中内生的短链非编码RNA,长约22nt(nt是核苷酸nucleotide的缩写,lnt代表一个核苷酸单位)。MicroRNAs可以通过作用于相应靶基因调控细胞增殖、凋亡、分化、发育、侵袭和转移,甚至还可以调节干细胞活化及新生血管生成。MicroRNAs基因通常位于在癌基因组的染色体脆性位点,被认为是一类新型的致癌基因和抑癌基因。在大多数实体瘤和血液系统恶性肿瘤中都发现MicroRNAs表达水平的异常。这些异常表达的MicroRNAs还可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的迁移性、下调多种靶基因的表达等等。脑部肿瘤MicroRNAs表达谱的一系列的研究也发现一些MicroRNAs的表达异常。这些表达异常的MicroRNAs基因位点通常位于典型的脑肿瘤的上游或下游信号通路,能调节脑肿瘤细胞的致癌表型。MicroRNA-124在各种哺乳动物的胚胎和成年皮质中大量表达,是一类脑组织中表达最为丰富特有的microRNA,约占脑组织microRNAs总量的25%～48%。MicroRNA-124对于维持正常的神经发育和功能有着重要的作用。对神经胶质瘤不同的表达谱的研究却发现miR-124在恶性程度较高的间变性星形细胞瘤(Ⅲ级)和多形性胶质母细胞瘤(Ⅳ级)中的表达量是显著下调的,提示miR-124的下调在神经胶质瘤形成和进展过程中发挥着关键作用。miR-124在神经胶质瘤中表达的恢复抑制了各种靶基因的表达,如lamininγ1和整合素β1,也抑制了肿瘤的转移和侵袭,从而延缓肿瘤的进展。miR-124-3p(miR-124或者miR-124a)和miR-124-5p(miR-124*)都是miR-124的两种成熟的形态(miR-124-5p在LAMB1的3’UTR一个公认的结合位点是由鸟嘌呤取代胞嘧啶而发生突变[星号标记])。miR-124-3p已证实在高级别胶质瘤中的表达是下调的,而且与胶质瘤患者预后相关。但是miR-124-5p在神经胶质瘤中的表达是否和niR-124-3p的结果一致还是未知数。因此,筛选出miR-124在胶质瘤发展调控网络中确切的靶标基因,对于胶质瘤的诊疗非常有意义。基于我们先前研究观察到GBM细胞系和组织中lamininβ1蛋白的高表达和miR-124-5p的低表达与胶质瘤进展关系,我们设想这两者之间在胶质瘤进展中是否存在相关关系。因此,本研究就针对miR-124-5p对lamininβ1的潜在调节机制进行探讨。我们首先通过Q-PCR和WesternBlot方法检测GBM细胞系(U87和U251)及不同级别临床胶质瘤标本中miR-124-5p与LAMB1之间的表达水平,利用双荧光素酶检测系统验证miR-124-5p对LAMB1(蛋白质)表达的调控作用。通过体内、外研究对胶质瘤细胞系和组织中miR-124-5p的高表达和LAMB1的敲减对于细胞增殖、克隆形成、肿瘤生长和血管生成所产生的影响进行评估,验证miR-124-5p对LAMB1潜在的调节作用。第一部分各级别神经胶质瘤层粘连蛋白-8和miR-124-5p的表达关系目的：检测层粘连蛋白-8LAMB1mRNA和蛋白,miR-124-5p在各级别神经胶质瘤中的表达水平,并分析它们与神经胶质瘤进展之间是否存在关联。方法：人U87和U251胶质瘤细胞系进行培养。于珠江医院神经外科和病理科各级别胶质瘤组织标本进行采集及处理。采用Q-PCR和Westernblots检测非肿瘤性脑组织、Ⅰ/Ⅱ级胶质瘤、间变性星形细胞瘤(AAs,WHOⅢ级),多形性胶质瘤母细胞瘤(GBMWHOⅣ级)和U87、U251胶质瘤细胞系中的LAMB1mRNA和蛋白、miR-124-5p的表达水平。结果：LAMB1mRNA和蛋白在AAs和GBM组织中的表达水平相比较于正常脑组织和Ⅰ/Ⅱ级神经胶质瘤表现出显著上调,胶质母细胞瘤组织中的LAMB1表达量最高。MiR-124-5p在间变性星形细胞瘤(AAs,WHOⅢ级)和多形性胶质母细胞瘤(GBMWHOⅣ级)的表达量与正常脑组织和Ⅰ/Ⅱ级胶质瘤相比显著下调。对miR-124-5P表达水平与LAMB1mRNA和蛋白表达水平进行秩相关分析：miR-124-5p表达水平与LAMB1mRNA和蛋白表达水平呈负相关关系。结论：LAMB1mRNA和蛋白的表达水平随着神经胶质瘤级别和严重程度的增加而提高,而miR-124-5p表达水平随着神经胶质瘤级别和严重程度而下降,因此,miR-124-5p和LN-8可以作为神经胶质瘤的生物标志物。下调的miR-124-5p和上调的LAMB1与胶质瘤进展相关,两者之间呈负相关关系。第二部分Has-miR-124-5p调控LAMB1基因的表达目的：验证miR-124-5p是否对LAMB1转录后水平具有调控作用。方法：采用MicroCosmTargetsVersion5microRNA靶基因预测软件insilico分析miR-124-5p在LAMB13’UTR端结合位点。MiR-124-5pminic、NC(miRNAminicnegativecontrol)、miR-124-5pinhibitor和miRNANCinhibitor脂质体转染U87和U251胶质瘤细胞,分别利用Q-PCR和Westernblots检测U87和U251胶质瘤细胞中LAMB1mRNA和蛋白水平。我们还利用双荧光素酶检测系统鉴定miR-124-5p对LAMB1(蛋白质)表达的调控作用。结果：MicroRNA靶基因预测软件insilico分析显示miR-124-5p是LAMB13’UTR端结合位点。72小时后,转染miR-124-5pminic过表达miR-124-5pU87和U251细胞的LAMB1蛋白水平相比于转染NC的U87和U251细胞是下调的。转染miR-124-5pinhibitor的U87和U251细胞的LAMB1蛋白水平相比于转染NCinhibitor的U87和U251细胞是上调的。同时,LAMB1mRNA水平却不受过表达或敲低miR-124-5p的影响。miR-124-5p对LAMB1基因的翻译产生抑制作用。结论：miR-124-5p对U87和U251胶质瘤细胞LAMB1mRNA的表达无调节作用,对U87和U251胶质瘤细胞LAMB1(蛋白)的转录后水平表达有直接的负调控作用。LAMB1是：miR-124-5p直接的靶基因。第三部分MiR-124-5p表达恢复对异种移植胶质瘤肿瘤生长和微血管密度的抑制作用目的：评估miR-124-5p表达的恢复对于胶质瘤细胞增殖、细胞周期和迁移以及肿瘤生长和血管生成产生的影响。方法：1.体外实验：miR-124-5pminic和miRNAminicnegativecontrol(NC)脂质体转染U87胶质瘤细胞。利用MTT实验和Transwell细胞迁移实验对转染miR-124-5pminic和NC(miRNAminicnegativecontrol)的U87胶质瘤细胞的细胞增殖能力、细胞周期和细胞侵袭能力进行分析。2.体内实验：建立免疫缺陷nu/nu裸鼠U87和U251皮下胶质瘤动物模型。当肿瘤体积达到150-200mm3,将小鼠随机分配为2个处理组：miR-124-5pminic组和NC组(每组n=6),分别给予miR-124-5pminic和NC原位注射处理,监测3个星期的肿瘤体积变化情况。利用Q-PCR,Westernblots和免疫组化技术检测各组肿瘤组织中LAMB1mRNA和蛋白水平变化；通过对肿瘤标本的肿瘤血管内皮标记物CD31行免疫组化分析肿瘤微血管密度的变化。结果：miR-124-5p对U87胶质瘤细胞的细胞增殖能力、细胞周期和细胞侵袭能力无调控作用。miR-124-5pminic组的肿瘤生长与NC组相比是受到抑制的。miR-124-5pminic组的LAMB1蛋白水平与NC组相比较是下调的,而niR-124-5pminic组的LAMB1mRNA水平与NC组相比较无统计学意义。miR-124-5pminic组的肿瘤微血管密度与NC组相比较明显下降。结论：miR-124表达的恢复通过抑制LAMB1基因的蛋白表达导致胶质瘤肿瘤血管生成和肿瘤生长受到抑制。
【作者】陈强；
【导师】张世忠；
【作者基本信息】南方医科大学，神经外科学，2014，博士
【关键词】胶质瘤；层粘连蛋白；MicroRNA；血管生成；

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