基于聚酰胺—胺的星状阳离子聚合物基因递释系统的构建及其性能评价

【摘要】基因治疗是通过将外源性的基因导入体内的受体细胞,修复或替换有缺陷、受损基因的一种选择性治疗手段。针对于新型药物的开发以及遗传类疾病、肿瘤、心血管疾病和免疫缺陷疾病的临床差别化治疗具有重要意义。众所周知,基因治疗的先决条件是基因的导入,即传递基因进入到需要表达的组织细胞中。而基因导入的关键是介导基因进入细胞的载体系统。现阶段,基因传递的载体系统分为病毒型载体和非病毒型载体两大类。尽管病毒型载体具有高转染效率和稳定表达基因,但存在非导向性和免疫原性等缺陷,因此大量的病毒型载体由于安全性隐患仍然被限制在临床上使用。相对于病毒型基因载体,非病毒型阳离子聚合物载体由于具有尺寸可控、特定的三维结构、安全性高以及多功能化的表面基团等特点而受到了日益广泛的关注。作为生物材料应用的聚酰胺-胺(Polyamidoamine,PAMAM)是非病毒阳离子聚合物基因载体家族中的重要组成之一,它是以乙二胺为核,通过迈克尔加成反应(Michaeladditionreaction)多次循环制备的,由于具有结构规整、分子量均一、纳米尺寸、内部空腔、表面高官能团密度,物理和化学性质可控等特点,PAMAM作为基因载体被广泛研究。虽然PAMAM的转染效率随着代数的增加而增加,但其细胞毒性也随之增强,而且PAMAM不具有抗血清能力,这极大的限制了PAMAM作为基因载体在体内的实际应用。如何提高PAMAM介导基因的转染效率并维持细胞活力,同时具有抗血清效果是研究人员目前面临的亟待解决的难题。本研究中,我们对PAMAM进行了功能化改性,采用α-环糊精(α-CD)作为内核,外部枝接低分子量PAMAM(PAMAM-G1,PAMAM-G2),合成了一种新型星状阳离子聚合物基因载体系统(α-CD-PAMAM)。通过对阳离子枝接聚合物的理化性质、细胞毒性、体外转染效果、细胞吸收途径等方面进行考察,评价该系统作为基因载体的有效性,具体内容如下：(1)我们使用羰基二咪唑(CDI)作为连接基团,对α-CD表面羟基进行活化,再枝接不同代数的PAMAM(PAMAM-G1和PAMAM-G2),制备一种新型星状阳离子聚合物体系(α-CD-PAMAM共聚物,分别为CD-PG1和CD-PG2)。(2)采用核磁共振(1H-NMR)和红外光谱(FT-IR)对合成的α-CD-PAMAM共聚物进行结构表征,计算环糊精的接枝率和共聚物的分子量,并通过软件模拟构建聚合物的空间构型。红外光谱结果表明α-CD在3400cm-1处的-OH吸收峰消失同时在1718cm-1处产生了新的-COO-吸收峰,证明PAMAM已成功被枝接在a-CD表面；通过1H-NMR数据计算出分别平均有6.4个PAMAM-G1和5.6个PAMAM-G2枝接在环糊精表面,CD-PG1和CD-PG2的分子量分别为1.02×104,1.89×104。(3)采用标准MTT法考察了阳离子聚合物CD-PG1和CD-PG2在不同细胞中的细胞毒性,同时以PAMAM-G1、PAMAM-G2、α-CD作为阴性对照,PEI-25K作为阳性对照进行对比。结果表明,在Hela、HEK、293A、BEL-7402和COS-7细胞中,在相同浓度测定条件下,自制阳离子聚合物CD-PG1和CD-PG2的毒性显著低于PEI-25K对照组,血清的存在可以改善细胞与聚合物共孵育时的细胞活性,IC50数据指出四种细胞对阳离子聚合物的耐受性大小分别为：HEK-293A>BEL-7402>COS-7>Hela。同时,以溶血实验考察聚合物CD-PGl和CD-PG2静脉注射安全性,结果表明PEI-25K溶血毒性严重,而自制聚合物CD-PG1和CD-PG2未见明显的溶血现象。(4)对CD-PG1/pDNA和CD-PG2/pDNA复合物的基本理化性质进行考察,利用凝胶阻滞电泳实验考察聚合物与DNA的结合压缩特性和保护DNA对抗核酸酶的作用。采用激光散射法对复合物的粒径、粒径分布、表面电位特征进行研究,同时考察血清对于粒子稳定性的影响。结果表明,CD-PG1和CD-PG2在N/P比≥6时,即可有效结合pDNA,而且在较低N/P比条件下即可保护pDNA免于核酸酶的降解,聚合物能在肝素钠的作用下释放出pDNA。两种聚合物形成的复合物粒径均小于150nm,粒径分布均一,在有血清条件下和不同的孵育时间下同样能够保持粒子的粒径稳定性。两种复合物粒子表面电位均大于+20mv。(5)考察CD-PG1/pDNA和CD-PG2/pDNA复合物在不同细胞系中的转染效果,以PEI-25K和Lipofectamine2000作为阳性对照比较其差异性,同时考察其在含血清条件下的转染情况。结果表明,CD-PG1和CD-PG2在HEK-293A细胞中最佳转染比分别为N/P=80和N/P=30,两种复合物无血清转染率为63.7%和71.2%,含血清转染率为77.1%和79.4%,且转染率高于阳性对照组PEI-25K(14.3％)和Lipofectamine2000(2.9%)；其他细胞系的转染结果趋势与HEK-293A基本一致,表明该系列载体具有优异的抗血清能力,能够在含血清环境中维持转染率水平。(6)采用激光共聚焦观察复合物在不同转染时间下进入细胞的特点,并结合流式细胞技术研究复合物在转染时限内进入细胞的动力学特征。结果表明,细胞在转染期间吸收复合物的过程为非线性增加,激光共聚焦观察发现转染4h时,荧光标记的复合物已经在细胞核内大量出现,表明该体系可以有效进行基因传递。(7)考察环糊精对于PAMAM介导的基因转染的影响,通过不同浓度α-CD的预先孵育转染结果研究转染是否具有环糊精浓度依赖性和不同细胞的普遍适用性。结果表明,与对照组PAMAM-G2相比,a-CD预先孵育细胞后可以促进PAMAM-G2/pDNA复合物的转染率,二者具有显著性差异(p=D.001,n=3)。当α-CD的孵育浓度≥0.5mg/mL时,其细胞转染率显著优于对照实验组(p=0.018,p=0.002,p=0.000,n=3)。不同细胞系中实验结果趋势一致,但在有血清条件下,细胞转染率均低于无血清条件测定结果,表明单纯α-CD不能改善PAMAM/pDNA复合物的抗血清作用。(8)采用相对转染率作为指标,考察不同影响因素对复合物细胞吸收的影响。结果表明,在低温(10℃)条件下孵育后,复合物被细胞吸收的比例仅达到正常孵育温度(37℃)的16.1%,当加入代谢抑制剂叠氮钠后,CD-PG2/pDNA的吸收也同样下降至69.5%,表明复合物是通过主动转运的方式被细胞摄取的。在高渗蔗糖溶液的存在下,由于液相内吞过程被抑制,细胞主动吸收复合物粒子水平下降至对照组的37.9%。采用盐酸氯丙嗪作为网格蛋白调控内吞途径(CME)抑制剂和genistein作为小窝调控内吞途径(CvME)抑制剂研究结果表明PAMAM类阳离子聚合物可通过这两种途径进入细胞。加入氯化铵会改变细胞内环境的pH值会使得内涵体pH降低,不利于复合物的逃逸致使pDNA不能有效释放进入细胞核表达。通过不同吸收途径的抑制剂考察α-CD的影响作用,在氯丙嗪实验组中,两结果具有显著性差异(p=D.034,n=3),表明α-CD可能会通过调节CvME途径增加复合物进入细胞的比例以此达到提升细胞转染效率的结果。(9)采用乳酸脱氢酶作为检测指标,通过对比不同浓度的PAMAM-G2溶液诱导细胞渗漏LDH,考察纳米孔洞的特点,并研究了不同孵育温度,不同PAMAM-G2浓度,α-CD浓度等影响因素。结果表明细胞膜表面纳米孔洞的形成与阳离子聚合物的浓度密切相关,PAMAM-G2的孵育浓度越高,测得的细胞清液中LDH活力越大,孵育温度较低时会限制磷脂膜的流动性从而降低LDH的渗漏。将不同浓度a-CD溶液与细胞共孵育后替换为PAMAM-G2浓度溶液培养,当α-CD溶液浓度≤0.5mg/mL时,LDH的渗漏无显著性差异(p=0.522,p=0.832,p=0.059,n=3),当浓度>0.5mg/mL时,LDH的渗漏与对照组相比具有显著性差异(p=D.000,n=3),说明高浓度的a-CD能够促进孔洞的形成。对比α-CD和β-CD的孵育结果发现与对照组相比,a-CD组具有显著性差异(p=D.000,n=3),而β-CD组则未见明显差异(p=0.696,n=3),提示LDH的渗漏可能是a-CD通过调节CvME途径或是增溶细胞膜表面的磷脂所致。
【作者】秦凌浩；
【导师】陈建海；
【作者基本信息】南方医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】聚酰胺-胺；α-环糊精；抗血清作用；细胞内吞；乳酸脱氢酶；

【参考文献】
[1]柳小芳.副词“很”和“真”的对比及留学生使用偏误分析[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[2]张玉香.中国农业信息体系建设发展战略研究[J].农业展望,2005,01:4-9.
[3]孙现军.工程项目风险管理的成本和效益分析研究[D].河北工程大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[4]王杰.重庆市产业结构对城镇化的影响研究[D].重庆工商大学,产业经济学,2014,硕士.
[5]宁岩.地塞米松预防晚期早产儿及足月儿呼吸窘迫综合征的疗效观察[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[6]李琦.合金薄膜传感器测量切削力技术的研究[D].中北大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[7]周家萱.油画中的黑色与白色[D].东北师范大学,美术学,2012,硕士.
[8]邵刚,田泽,刘颖,刘敏侠,王晋.一种宽温多协议时钟恢复电路的设计与实现[J].计算机技术与发展,2015,05:.
[9]陶璐.姜黄浸膏散制备工艺及其抗草鱼肝损伤的研究[D].湖北中医药大学,药物分析学,2013,硕士.
[10]李策.基于模糊三维计量模型的企业人力资源价值评价研究[D].兰州大学,会计,2014,硕士.
[11]吴小伟.颞叶癫痫患者脑灰质与白质的基于体素的形态测量学研究[D].厦门大学,影像医学与核医学,2014,硕士.
[12]车艳红.miR-143在宫颈鳞癌组织中的表达及意义[D].郑州大学,妇产科学,2013,硕士.
[13]辛晓平,杨正宇,田新智,高琼.放牧和围封条件下羊草碱化草地中斑块分布格局研究[J].植物生态学报,2000,06:656-661.
[14]张倩.中国奥锹甲属Odontolabis Hope和新锹甲属Neolucanus Thomson的分子系统学研究（鞘翅目：金龟总科：锹甲秋）[D].安徽大学,生态学,2013,硕士.
[15]林茜.保险合同解除权研究[D].华侨大学,法律,2013,硕士.
[16]于瞳.我国低碳审计若干问题研究[D].吉林财经大学,会计学,2014,硕士.
[17]王明年,郭军,罗禄森,喻渝,杨建民,谭忠盛.高速铁路大断面黄土隧道深浅埋分界深度研究[J].岩土力学,2010,04:1157-1162.
[18]张国庆.1990-2012年寿光市法定传染病流行趋势分析[D].山东大学,公共卫生（专业学位）,2013,硕士.
[19]武近冬.电解还原邻氯硝基苯的工艺研究[D].北京化工大学,2013.
[20]崔晓曦,林智声,蔡威曦,黄民聪.三相四线混合有源电力滤波器有源部分最小容量分析[J].电力系统自动化,2013,03:122-128.
[21]冯心斌.泉州开元寺研究[D].河北师范大学,考古学,2012,硕士.
[22]张春晓.若干非线性偏微分方程的对称与精确解[D].宁波大学,基础数学,2013,硕士.
[23]许明金.比较视角下利益集团影响政策过程研究[D].华中师范大学,行政管理,2014,硕士.
[24]朱娟.徐渭的绘画美学思想及其现代性意蕴研究[D].山东大学,文艺学,2013,硕士.
[25]李沂键.染料木素与异樱黄素抑制PC-9肺癌和U87-MG脑胶质瘤细胞的生长和增殖[D].华中科技大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[26]施健.基于信息化的埃美柯公司业务流程再造研究[D].宁波大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[27]李津.第三十届奥运会中国男篮与对手阵地进攻阶段投篮技术对比研究[D].北京体育大学,运动训练,2013,硕士.
[28]郭龙龙.川东南寒武系娄山关组白云岩储层特征及主控因素[D].成都理工大学,地质学,2013,硕士.
[29]姜晓洁.高可靠数管中心计算机的设计[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2010,硕士.
[30]申凯.论我国刑事诉讼中不起诉制约机制的构建与完善[D].中国社会科学院研究生院,刑事诉讼法（专业学位）,2014,硕士.
[31]方达.带有多重非线性临界项的拟线性椭圆方程组的研究[D].中南民族大学,应用数学,2013,硕士.
[32]孙欣欣.从翻译美学角度论中国古典诗歌的可译度[D].大连海事大学,英语语言文学,2013,硕士.
[33]何小勤.长江口崇明东滩现代地貌过程研究[D].华东师范大学,自然地理,2004,硕士.
[34]聂劲.订单在线排序问题的算法设计与分析[D].湖南师范大学,运筹学与控制论,2014,硕士.
[35]林洽渠.广州社会管理创新问题与对策研究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[36]郭微微.中俄输油管道沿线工程地质问题及地质灾害评价[D].黑龙江大学,水利水电工程,2013,硕士.
[37]李瑾,安树青,程小莉,王云静,卓元午,覃风飞.生态系统健康评价的研究进展[J].植物生态学报,2001,06:641-647.
[38]邹欢清,李九生.基于石墨烯的电可调太赫兹波移相器研究[J].电子元件与材料,2014,10:18-21.
[39]岳峰,左旺孟,张大鹏.掌纹识别算法综述[J].自动化学报,2010,03:353-365.
[40]王海英.爆炸-真空热处理条件下纳米洋葱状富勒烯的形成[D].太原理工大学,材料加工工程,2004,硕士.
[41]谢世强.基于神经网络非特定人语音识别与机器人控制研究[D].沈阳工业大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[42]李仁卿.毛泽东“新经济政策”探析[D].湘潭大学,中共党史,2003,硕士.
[43]张粒子,王茜,舒隽.基于聚类最优乘子向量的发输电系统可靠性评估[J].电力系统自动化,2011,06:14-19.
[44]刘正志.斯达模式:提高造纸企业整体竞争力——黑龙江斯达造纸有限公司企业信息化建设系列报道(之四)[J].中华纸业,2003,11:6-10.
[45]江兴.石墨烯+六方氮化硼=新的晶体管[J].半导体信息,2013,03:16-17.
[46]黄发华.民事诉讼法中电子数据的运用研究[D].南昌大学,诉讼法学,2014,硕士.
[47]刘叶.城市景观光环境艺术表现形式的研究[D].沈阳建筑大学,设计学,2012,硕士.
[48]杨延峰.机车车辆螺栓联结构可靠性分析[D].北京交通大学,2015.
[49]杨领.毛泽东新民主主义社会论研究[D].郑州大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2013,硕士.
[50]杨吉.孕妇羊水诊断认知程度及影响羊水诊断实施因素的研究[D].吉林大学,公共卫生,2012,硕士.