TAG1信号对胶质瘤干细胞增殖与分化的作用及相关基因调节机制的研究

【摘要】研究背景胶质瘤(glioma)是最常见的颅内原位实体瘤,约占原发性神经系统肿瘤的29%,占恶性脑肿瘤的80%。其中恶性胶质瘤增殖迅速、侵袭度高、致死率高,已成为中枢神经系统疾病中最难治疗的疾病之一。虽然随着临床手术治疗、放疗、化疗等治疗技术的综合运用,胶质瘤的临床疗效与预后仍然没有明显改善。随着对胶质瘤研究的深入而广泛的开展,胶质瘤干细胞(Gliomastemcells,GSCs)的发现及其理论与研究逐渐受到关注。胶质瘤干细胞是指胶质瘤中的一小部分因具有自我更新、无限增殖和分化成瘤等干性特征的细胞,是胶质瘤的成瘤细胞；胶质瘤干细胞因其干性特征被认为是胶质瘤发生、发展及复发的根源。因此,有关胶质瘤干细胞的行为学及其相关机制的研究,对寻找胶质瘤更为有效的治疗新“靶标”具有重要意义。目前研究认为,一些相关基因、受体、信号分子的异常表达及其相关的信号转导通路可能涉及胶质瘤的发生与发展。细胞微环境中的信号分子及其相关的信号通路也可能导致胶质瘤干细胞增殖、分化等生物学行为的变化。因此,多方面了解胶质瘤干细胞的相关信号变化,发现新的胶质瘤干细胞信号通路并进行深入探索已成为目前胶质瘤干细胞的研究热点。TAG1(transientaxonalglycoprotein-1,瞬变轴突糖蛋白1,也可称为TAX1,Contactin2,CNTN2,Axoninl)是一种细胞表面黏附分子,属于免疫球蛋白家族Contactin/F3亚家族,主要表达在中枢神经系统发育发展过程中。以往研究认为,TAG1的生理功能主要是作为一种细胞粘附分子引导神经细胞的粘附、迁移以及引导神经轴突的生长,但其具体的作用途径或模式目前还不清楚。研究发现TAG1与胶质瘤可能相关,在胶质瘤组织细胞及胶质瘤细胞系细胞中均有检测出TAG1的表达。我们实验室同事的研究则发现TAG1信号可能通过某种细胞信号途径以促进胶质瘤增殖的方式参与了胶质瘤的发生发展。此外,TAG1信号可能通过SHH信号通路对胶质前体细胞起增殖促进及分化抑制的作用。但TAG1在胶质瘤干细胞中的相关作用仍不清楚。APP(Aβ前体蛋白,Amyloidβprecursorprotein,APP)是新发现的TAG1的一种受体信号。APP广泛的表达在神经系统中,在神经干细胞中也有明确表达。研究显示,APP作为一种维持细胞与细胞间以及细胞与细胞外间质间的细胞信号,所涉及的生理作用也非常广泛,如细胞的迁移、神经细胞的分化与再生、突触发育、神经保护等。其次,APP通过特异性的水解酶的剪切所产生的APP胞内剪切片段AICD(APPintracellulardomain,AICD)可作为APP信号的直接传导分子进入细胞核内参与细胞信号传导。研究发现,APP及AICD均有可能与胶质瘤相关：APP在胶质瘤细胞系细胞中存在有过表达的现象,这种过表达可能涉及到胶质瘤细胞的异常增殖和异常形态；APP也可能导致外源性的神经干细胞或神经前体细胞向胶质细胞方向分化增加。而AICD可能与Notch蛋白的胞内片段NICD相互作用,通过上调NICD及Hesl的表达或直接上调Hesl的表达而促进肿瘤的产生,同时AICD可使神经祖细胞的胶质发生增加。但是APP与AICD在胶质瘤中的具体作用及可能的机制仍不明确。由于TAG1/APP信号最初发现在神经干细胞中,而在普通的胶质瘤细胞中也发现有TAG1及APP信号分子的表达,故本实验选择胶质瘤干细胞为研究对象,研究TAG1/APP信号在胶质瘤干细胞中的表达情况,并对其涉及的可能的作用机制进行探讨,以期为胶质瘤的治疗提供新线索。本研究拟分为三个部分。第一章人胶质瘤细胞系中胶质瘤干细胞的分离、培养和鉴定目的：从人源性U87胶质瘤细胞株中分离培养并扩增U87胶质瘤干细胞,并对其干性特征进行鉴定。为研究胶质瘤干细胞的信号通路奠定基础。材料与方法：采用无血清培养基(DMEM/F12+20ng/mLbFGF+20ng/mLEGF+2%B27),在1%氧浓度培养条件(1%O2,5%CO2,94.5%N2,98%湿度,37℃)下进行U87胶质瘤干细胞的分离及扩增培养。对扩增所获得的肿瘤球细胞进行形态观察；使用干性标记物进行干细胞表面标记的鉴定；使用常规含血清培养基(DMEM/F12+10%FBS)进行肿瘤球细胞的分化诱导,鉴定分化细胞表型以检测肿瘤球细胞的多向分化能力；通过裸鼠皮下成瘤实验鉴定肿瘤球细胞的成瘤性；采用细胞增殖性实验CCK-8(CellCountingKit-8)测定并绘制肿瘤球细胞的生长曲线,以了解肿瘤球细胞的增殖特性。结果：人U87胶质瘤细胞系细胞在含血清培养基中呈贴壁生长,胞体有突起,细胞可呈梭形、星形、多角形。经无血清培养基低氧浓度培养,可呈悬浮状态生长,形成悬浮肿瘤克隆球；这些肿瘤球细胞可以被反复消化传代至少1个月以上。使用免疫细胞化学染色检测,所获得的U87肿瘤球细胞可表达干性标记物CD133和Nestin;使用流式细胞仪检测,干性标记物CD133和Nestin阳性率可以达到90%以上。将U87肿瘤球细胞转入含血清培养基中进行诱导分化,可重新分化成贴壁细胞,形态与亲本U87细胞相似,经过神经系统三系细胞(星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞)标记物鉴定,可表达星形胶质细胞(GFAP)、神经元(Ⅲβ-tubulin)、和不成熟少突胶质细胞(01)标记物。将U87肿瘤球细胞进行裸鼠皮下种植,可观察到肿瘤球细胞所形成的皮下移植瘤。通过生长曲线的绘制,与普通U87胶质瘤细胞的生长速度(1天：0.520±0.006,3天：0.690±0.010,5天：0.964±0.014)相比,U87肿瘤球细胞的生长速度(1天：0.855±0.049,3天：1.452±0.139,5天：1.925±0.051)较快,统计学分析显示细胞种类和时间因素存在交互效应(F=37.359,P=0.000)；进行单独效应分析,固定三个时间点两组间存在差异(p<0.05)。结论：人U87胶质瘤细胞系中存在有具无限增殖、自我更新及多向分化潜能的胶质瘤干细胞,通过低氧无血清培养基可以对U87胶质瘤细胞中的胶质瘤干细胞进行分离培养及有效扩增。第二章TAG1/APP信号通路在胶质瘤干细胞增殖与分化中的表达目的：研究胶质瘤干细胞增殖与分化培养过程中TAG1/APP信号的表达情况,以分析TAG1/APP信号与脑胶质瘤干细胞增殖和分化的关系。方法：以体外分离培养的第5代以后的U87胶质瘤干细胞作为胶质瘤干细胞模型,使用无血清培养基(DMEM/F12+bFGF20ng/ml、EGF20ng/ml、B270.2%)在常规氧浓度37℃,5%C02培养箱中培养进行增殖培养3天；含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在常规氧浓度37℃,5%CO2培养箱中诱导分化0、1、5天；分别通过使用qRT-PCR及Westernblot方法,检测细胞中TAG1和APP的表达。结果：U87胶质瘤干细胞呈悬浮球样增殖扩增,通过第5代以上的收集球细胞进行TAG1、APP的qRT-PCR基因表达检测和Westernblot蛋白表达检测。与普通U87胶质瘤细胞相比较,在U87胶质瘤干细胞增殖时,TAG1的mRNA表达(2.427±0.690)和APP的mRNA表达(1.413±0.146)均呈现增强(t=-3.581,P=0.023及t=-4.913,P=0.039);TAG1和APP的蛋白表达在U87胶质瘤干细胞(TAG1:0.203±0.042,APP:0.643±0.015)中也较普通U87胶质瘤细胞中(TAG1:0.103±0.025,APP:0.497±0.021)均有增强(t=-3.560,P=0.024及t=-9.839,P=0.001)。U87胶质瘤干细胞在含10%胎牛血清的普通培养基中分化时,随着分化的进行,可以观察到TAG1及APP的mRNA在分化第1天(TAG1：1.033±0.087,APP：0.927±0.065)仍然有较高表达,与未分化时TAG1及APP的mRNA表达(均为1)相比较差异不显著；而随着分化出的成熟普通胶质瘤细胞比例增多,TAG1及APPmRNA的表达在第5天出现下降(TAG1：0.527±0.110,APP：0.533±0.098),与分化第1天相比较差异显著(分别是t=6.258,P=0.003和t=5.785,P=0.004)。分化过程中,TAG1与APP蛋白的表达情况与其mRNA情况相一致。与未分化状态相比较(TAG1:0.557±0.021,APP:0.663±0.021),在U87胶质瘤干细胞分化第1天TAG1及APP的蛋白表达(TAG1：0.523±0.032,APP：0.623±0.031)无明显减弱,统计分析差异不显著；而随着分化过程的进展,TAG1及APP的表达减弱(TAG1:0.417±0.015,APP:0.477±0.015),与分化第1天的TAG1及APP的相对表达量相比较出现显著性差异(P=0.002和P=0.000)。结论：TAGl/APP信号在U87胶质瘤干细胞中存在异常高表达；TAG1/APP信号通路的异常可能涉及U87胶质瘤干细胞中增殖的维持及分化的启动。第三章TAG1/APP信号通路对胶质瘤干细胞增殖与分化的调控作用目的：干扰U87胶质瘤干细胞中TAG1的表达,观察下调TAG1信号后脑胶质瘤干细胞增殖和分化行为的变化及对EGFR与Hes1信号的影响,以探讨TAG1/APP/EGFR和TAG1/APP/Hes1信号调控对胶质瘤干细胞的潜在致病机制。方法：根据人CNTN2基因序列,设计构建4个miRNA干扰载体(CNTN2-1、2、3、4),并通过测序进行鉴定；通过对U87胶质瘤干细胞进行瞬时转染后用Westernblot进行干扰效率筛选；对干扰效率最好的一组进行进行慢病毒构建包装。按照MOI=100对U87胶质瘤干细胞进行转染,72小时后观察细胞生长状态及绿色荧光的表达。使用CCK-8细胞增殖活性检测及干细胞球数量与大小测定评估RNAi-TAGl对U87胶质瘤干细胞增殖的影响,使用U87胶质瘤干细胞分化后GFAP表达量及U87胶质瘤干细胞移植后成瘤大小评估RNAi-TAG1对U87胶质瘤干细胞分化的影响。使用qRT-PCR及Westernblot方法,检测增殖状态下及分化过程中AICD、EGFR、HES1表达的变化。结果：经过Westernblot检测发现CNTN2-2所产生的干扰效果最佳,将其成功构建为Lenti-EGFP-CNTN2-miR,并以Lenti-EGFP-NC-miR作为空病毒对照。对TAG1信号进行RNAi后胶质瘤干细胞增殖受到抑制,与Lenti-EGFP-NC-miR空病毒对照组各时间点增殖活力(48小时：0.757±0.012,72小时：1.297±0.018,96小时：1.377±0.044)相比较,Lenti-EGFP-CNTN2-miR干扰组CCK-8各时间点增殖活力(48小时：0.578±0.008,72小时：0.963±0.100,96小时：1.154±0.035)；绘制生长曲线进行析因分析显示细胞种类和时间因素存在交互效应(P=-3.202,P=-0.038),因此着重进行单独效应分析,固定三个时间点两组均有差异(P<0.05);RNAi-CNTN2组U87胶质瘤干细胞增殖活力明显降低(P<0.05)。对干扰后U87胶质瘤干细胞的体外成球情况进行分析；肿瘤球的数量在RNAi-CNTN2组：24.000±3.606,在NegCtrl组：32.667±3.055;多重比较结果显示,与NegCtrl组相比较,RNAi-CNTN2组肿瘤球的数量明显减少(P=0.015)。肿瘤球的直径在RNAi-CNTN2组：89.337±10.097,在NegCtrl组：124.193±21.759；多重比较结果显示,与NegCtrl组相比较,RNAi-CNTN2组肿瘤球的直径明显减小(P=0.008)。对TAGl信号进行RNAi后胶质瘤干细胞的分化也受到抑制,与Lenti-EGFP-NC-miR空病毒对照组相比,Lenti-EGFP-CNTN2-miR干扰组分化第5天时的GFAP表达量均较未转染空白对照组明显降低(RNAi-CNTN2组：0.1647±0.004,NegCtrl组：0.5656±0.008；F=1651.841,P=0.000)；20天时裸鼠皮下肿瘤的体积有明显的较小(RNAi-CNTN2组：1638.385±329.656,NegCtrl组：2383.348±301.801;F=9.817,P=0.008)。Westernblot检测结果显示,RNAi-TAG1转染48小时后胶质瘤干细胞,与空病毒转染对照组相比较,RNAi-CNTN2组U87胶质瘤干细胞中APP表达无明显变化(F=9.719,P=0.131)；AICD的表达则呈现明显减少(RNAi-CNTN2组：0.302±0.007,NegCtrl组：0.865±0.056；F=121.417,P=0.006)。在诱导分化后第3天时,Lenti-EGFP-CNTN2-miR组中U87胶质瘤干细胞的GFAP的蛋白表达明显减少(F=1651.841,P=0.000)。通过qRT-PCR检测显示,EGFR和Hes1的基因表达,RNAi-CNTN2组较NegCtrl组明显降低(F=26.967,P=0.048,和F=1598.701,p=0.000)。Westernblot检测结果显示,EGFR蛋白相对表达量(RNAi-CNTN2组：0.121±0.011,NegCtrl组：0.754±0.021),Hesl蛋白的相对表达量(RNAi-CNTN2组：0.133±0.004,NegCtrl组：0.418±0.003),与NegCtr1组相比较,RNAi-CNTN2组中EGFR和Hes1的蛋白表达明显减少,差异具有显著性(F=765.277,P=0.000和F=3580.478,P=0.000)。结论：RNAi-TAG1信号可能通过TAG1/APP/AICD/Hes1信号及TAG1/APP/AICD/EGFR信号途径对U87胶质瘤干细胞的增殖与分化产生抑制作用,抑制TAG1信号可能为胶质瘤的治疗提供新的线索。
【作者】郭阳；
【导师】徐如祥；
【作者基本信息】南方医科大学，神经外科学，2014，博士
【关键词】TAG-1(瞬变轴突蛋白-1)；APP(淀粉样前体蛋白)；AICD(淀粉样前体蛋白胞内段)；胶质瘤干细胞细胞行为学；

【参考文献】
[1]何海.灰色动态建模技术与应用[D].华中科技大学,2004.
[2]郝宇.X电信公司运营业务流程优化方案研究[D].华南理工大学,工业工程,2012,硕士.
[3]沈聪.农村小额信贷现状分析[D].内蒙古农业大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[4]靖长亮.不同填料改性PI复合材料机械性能研究[D].南京农业大学,机械设计及理论,2011,硕士.
[5]李文岩.硅胶表面壬基酚分子印迹聚合物的制备及其在固相萃取中的应用[D].黑龙江大学,环境科学,2013,硕士.
[6]舒丹.泛发性脓疱性银屑病患者IL36RN和CARD14基因突变检测及相关研究[D].北京协和医学院,皮肤性病学（专业学位）,2014,博士.
[7]俞露.美国中小学公民教育初步研究[D].福建师范大学,比较教育学,2004,硕士.
[8]汪龙虎.基于MSP430摩托车路试仪检定装置的设计[D].华东交通大学,车辆工程（专业学位）,2012,硕士.
[9]翟敬梅,蒋梁中,徐晓,谢存禧.基于数据驱动的生产质量决策支持系统模型的研究[J].机械设计,2003,03:14-16+19-20.
[10]张艳红.馆藏资源数字化方法研究[D].武汉大学,2004.
[11]毕旭静.汽车制造业逆向物流模式选择研究[D].北京交通大学,2013.
[12]李冬旭.“Group search”游戏在菲律宾主流中学汉语教学中的应用[D].西北大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[13]刘立山.中国电影评奖制度研究[D].西南大学,电影学,2013,硕士.
[14]罗勇刚.多突发事件耦合情况下交通特性研究[D].华中科技大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[15]黄南霞.大数据环境下的网络协同创新体系研究[D].华中师范大学,企业管理,2014,硕士.
[16]邓朝芳.连续法制备N，N-二甲基-1，3-丙二胺的工艺研究[D].大连理工大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[17]陈风雷.牡丹江地区小城镇建设对县域经济推动研究[D].吉林大学,农业推广,2012,硕士.
[18]高慧强.振动时效设备的研究与开发[D].东北大学,机械电子工程,2010,硕士.
[19]王佐伟,吴宏鑫.非线性离散时间系统的自适应模糊补偿控制[J].控制与决策,2005,02:147-151.
[20]张明庆,杨国栋,许晓波.树木花期预报的花芽形态测量法研究——以大山樱花期预报为例[J].植物生态学报,2005,04:610-614.
[21]张丽君.注册会计师审计质量存在的问题及对策研究[D].首都经济贸易大学,会计学,2013,硕士.
[22]赖文敬,鲍鸿,白玉磊,申作春,周延周.叶片三维轮廓测量点云数据高精度多角度融合[J].航空动力学报,2015,03:665-671.
[23]张文静.金属橡胶密封件泄漏率分析及试验研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2014,硕士.
[24]李佳月.湘教版地理必修Ⅱ“城市与环境”实践活动教学策略设计[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[25]曹泰然.潍坊XX房地产项目风险管理研究[D].华侨大学,项目管理（专业学位）,2013,硕士.
[26]ABHISHEKSHAH.计算机断层扫描（CT）扫描主动脉瘤的研究[D].吉林大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[27]秦学礼.过程系统工程与集约化经营的现在和未来[J].微计算机信息,2001,09:1-3.
[28]崔德明.弹性管理：多变世界中的教师管理理念与对策[D].湖南师范大学,教育,2004,硕士.
[29]张晓莹.加减木香导滞丸治疗湿热蕴脾型小儿急性肠系膜淋巴结炎临床研究[D].广州中医药大学,中医儿科学,2013,硕士.
[30]孙海.奥迪4S店客户流失原因分析及服务改进对策研究[D].吉林大学,工商管理,2014,硕士.
[31]陈琰.国有钢铁企业人才流失原因及对策研究[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[32]范晓梅.青少年网络道德教育研究[D].山西师范大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[33]高艳芳.磁场辅助静电纺丝制备PVP有序纳米纤维的研究[D].中北大学,材料学,2014,硕士.
[34]王觅.云水谣古村保护与发展的现实困境及对策研究[D].华侨大学,建筑学,2014,硕士.
[35]刘玉芹.消费者对转基因食品消费态度的实验经济学研究[D].上海交通大学,应用经济学,2014,硕士.
[36]李保奎.安徽省农民财产性收入增长的制度障碍与创新[D].安徽农业大学,农村区域发展,2012,硕士.
[37]孙科.Mn/TiO_2基低温SCR脱硝催化剂成型工艺及性能的研究[D].浙江大学,2013.
[38]伍艳辉.供应链全流程品质管理体系构建与应用研究[D].广东工业大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[39]谢锦春.近红外单籽粒稻谷品质无损测定研究[D].中国农业大学,生物物理,2004,硕士.
[40]胡琰.Ad Hoc网络中避免路由断裂的AODV算法改进[D].湖南大学,计算机技术,2011,硕士.
[41]张占龙,杨霁,熊兰,何亮.基于微波感应技术的语音报警器[J].电力系统自动化,2006,17:94-96.
[42]王惠坡.基于决策树的货票数据挖掘系统的研究[D].郑州大学,2003.
[43]张行.图书馆总分馆制的特点及建设方法[D].东北师范大学,图书馆学,2012,硕士.
[44]刘潇.Q_3黄土真三轴试验及强度研究[D].长安大学,地质工程,2014,硕士.
[45]邹坤.无铅钎料与不锈钢焊盘界面反应及其对焊点可靠性影响[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[46]高靖蕾.刑事辨认笔录研究[D].西南政法大学,刑事诉讼法学,2012,硕士.
[47]王伟平,李建中,张冬冬,郭龙江.一种有效的挖掘数据流近似频繁项算法[J].软件学报,2007,04:884-892.
[48]陈思敏.基于XML的多媒体课件创作系统的研究与实现[D].华东师范大学,系统分析与集成,2002,硕士.
[49]于晓玲.改善内蒙古星火科技12396信息服务体系的方案设计与实施[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[50]王守相,张颖,韩亮.配电系统三相不确定谐波潮流的复仿射计算方法[J].电力系统自动化,2015,07:41-46+110.