胰高血糖素样肽-1对晚期蛋白氧化产物诱导的胰岛微血管内皮细胞损伤的保护作用及机制

【摘要】研究背景糖尿病(diabetesmellitus,DM)的患病率在全球逐年增加,已成为继心血管疾病和肿瘤之后威胁人类健康的第三大慢性非传染性疾病。随着我国人们生活水平的提高及生活方式的改变,2型糖尿病(T2DM)的发病率也呈现出高速发展的趋势。根据2013年最新流行病学调查研究结果,我国18岁及以上成人中,按照国际最新临床诊断标准进行诊断的糖尿病估测患病率为11.6%,约1.139亿人,而更令人震惊的是中国成年人群中糖尿病前期(IGT)患病率已高达50.1%,且糖尿病发病呈现年轻化趋势。糖尿病所引起的各种急慢性并发症,特别是血管并发症已成为其致残致死的主要原因,严重影响人类的生活质量和寿命。胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)和胰岛β细胞功能减退是2型糖尿病发病的两大主要原因,现有的糖尿病治疗手段通过促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗、抑制葡萄糖的吸收及抑制肝糖输出为主,这些手段虽能起到改善血糖的作用,但随着病程的进展,仍然无法阻止胰岛β细胞功能的进行性衰竭。近年来更多的研究支持胰岛微循环障碍与β细胞的损伤及功能衰竭密切相关。胰岛是一个高度血管化的微器官,胰岛微血管既是胰岛细胞与机体的关键连接,又是其赖以生存的微环境。胰岛具有独特的微血管系统,含有密集的毛细血管网络,毛细血管网的密度大约是周围外分泌组织的5倍,丰富的血供不仅能够满足胰岛自身对氧气及营养物质的需要,更重要的是使胰岛能够迅速感知体内代谢环境的变化,通过血液循环将分泌的各种激素快速分布到相应的靶组织,从而调节机体代谢平衡。因此,胰岛微循环系统是胰岛内分泌功能重要的调节器。胰岛微循环结构和功能的完整性有赖于另一群目前开始被关注的细胞即胰岛微血管内皮细胞(isletmicrovascularendothelialcells,IMECs)。IMECs是构成胰岛微循环组织屏障的最主要成分,与胰岛内分泌功能关系密切,直接参与糖尿病胰岛功能衰竭的发生发展过程。随着胰岛微血管在2型糖尿病发病中的作用被逐渐揭示,TalMG2009年提出：β细胞功能衰竭很可能是胰岛微血管病变的表现,而各种原因导致的胰岛微血管内皮细胞的功能紊乱及损伤是引起胰岛微血管病变的重要因素,继而引起胰岛微循环的缺血缺氧,最终导致胰岛β细胞功能的进行性衰竭。因此,深入研究胰岛微血管内皮细胞功能紊乱及损伤的病理生理机制,探讨有效改善的方法和手段,对于保护胰岛细胞功能寻找防治2型糖尿病发病的新靶点具有重大意义。血管内皮细胞功能损伤及紊乱是糖尿病循环系统并发症发生发展的前提及基础。糖毒性、脂毒性、血液流变学及血流动力学改变、组织抗氧化能力减弱等因素与血管内皮细胞功能紊乱息息相关,主要表现为舒张血管因子一氧化氮合成减少,缩血管因子内皮素1产生增加,直接刺激动脉内膜下平滑肌细胞增生及纤维连接蛋白和胶原IV的表达。高血糖时血管内皮细胞合成和释放细胞间黏附因子1(ICAM-1)及血管细胞黏附因子1(VCAM-1)增多,增加白细胞和血小板的粘附能力并导致炎症细胞的活化及内膜炎症损伤,这种内皮细胞功能改变使中层平滑肌细胞向内膜下迁移,细胞内脂质沉积,从而加速血管动脉粥样硬化的形成。而胰岛微血管内皮细胞作为全身血管内皮细胞的一种也必然遭受到糖尿病状态下各种致病因素的损伤导致内皮细胞功能障碍,并进而影响到胰岛微循环的功能状态而最终导致胰岛细胞功能损伤。高级氧化蛋白产物(advancedoxidativeproteinproducts,AOPPs)是次氯酸对蛋白质氧化修饰生成的含双酪氨酸的蛋白交联物,是一种新发现的蛋白类大分子氧化应激标志物。最初在透析患者中发现AOPPs的积聚,随后在糖尿病和肥胖患者中也发现了AOPPs的积聚,AOPPs是一种氧化应激的蛋白标志物,它的结构和生物学作用类似于晚期糖基化终末产物(AGEs),也可通过受体RAGE活化血管内皮细胞NADPH氧化酶,激活氧化还原反应敏感的细胞内信号传导途径如ERK1/2、p38MAPK途径以及NF-kB的核转位,从而诱发血管内皮细胞的炎症和氧化应激损伤。慢性AOPPs负荷可以导致动脉壁氧化低密度脂蛋白的沉积增加,加剧动脉内膜及内皮细胞的氧化应激及炎症损伤导致高脂血症家兔动脉粥样硬化斑块的形成明显加速。在CKD患者,循环AOPPs水平和颈动脉粥样硬化病变程度密切相关,提示AOPPs潴留可能参与了CKD的加速性动脉粥样硬化。GradinaruD等探讨了糖尿病前期及糖尿病阶段患者中AOPPs水平与内皮源性NO合成酶、氧化应激、代谢谱及其他导致动脉硬化的因素之间的关系,发现AOPPs与正常对照人群相比显著身高,并显著抑制内皮源性一氧化氮合成酶的活性,导致内皮源性NO合成减少,在老年糖尿病患者中AOPPs水平的高低与糖尿病动脉粥样硬化紊乱的程度密切相关。BansalS等对印度265例2型糖尿病患者进行了RAGE的基因多态性分析及其与氧化应激产物、对氧磷酶及糖尿病大血管并发症的相关性分析,发现RAGE基因多态性中-429T/C基因型与血清氧化应激产物的水平及糖尿病大血管并发症的发生具有正相关性。由此可见,AOPPs不仅是氧化应激的标志物,其本身也作为一种强效促炎性因子加速了机体动脉粥样硬化进程,损伤全身的大血管及微血管系统。然而,有关AOPPs在胰岛微循环中的作用尤其是对胰岛微血管内皮细胞功能的影响仍少见报道。GLP-1是主要由肠道内分泌L细胞分泌的多肽,作为一种安全、有效的促胰岛素分泌剂越来越受到关注,是治疗2型糖尿病的一种新途径。越来越多的研究表明,GLP-1除了具有促进胰岛p细胞增殖、促进胰岛素分泌、抑制食欲、减缓胃肠道平滑肌的蠕动、抑制胰高血糖素释放等作用之外,还有胰外的心血管保护作用。GLP-1受体(GLP-1R)在血管平滑肌、心肌、心内膜、冠脉内皮均有表达,GLP-1R激动剂对心肌的缺血一再灌注损伤具有保护作用,并能改善心脏功能。exendin-4能显著缩小体外离体心脏心肌梗塞面积,exendin-4和GLP-1均能使左室收缩功能增强。Timmers等同样发现exendin-4持续治疗可显著减少冠状动脉结扎后实验猪的心肌梗塞面积,并促进心肌收缩和舒张功能的恢复。GLP-1可抑制单核细胞粘附于人主动脉血管内皮细胞,减轻血管性炎症损伤,阻止动脉粥样硬化的进展。在胰岛素抵抗和高血压的大鼠体内补充GLP-1,可以改善血管内皮功能、改善血压以及心功能。在临床病例观察研究中GLP-1可使2型糖尿病合并稳定冠心病患者的血管内皮功能得到改善。近年有研究者证实,在体外用糖基化终末产物诱导内皮细胞损伤,发现GLP-1可通过其受体显著下调RAGE受体的表达和细胞间粘附分子-1的水平,从而拮抗AGEs-RAGE轴导致的内皮细胞氧化应激损伤,减少血管损伤后内膜的增厚和平滑肌的增殖,具有潜在的抗炎和抗动脉粥样硬化作用。Exendin-4可经由PI3K/Akt-eNOS信号传导通路而促进内皮细胞增殖。在内皮细胞功能障碍和动脉粥样硬化的小鼠模型研究中,GLP-1受体激动剂利拉鲁肽可改善血管内皮细胞功能障碍,并减轻小鼠的动脉粥样硬化程度。2012年国内研究者发现GLP-1可通过激活PI3K/Akt信号转导通路减轻AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡,这种抗凋亡作用是通过对AGEs诱导的内皮细胞Bc1-2、Bax、cyto-c表达来实现的。2013年Erdogdu.O等进行了GLP-1对脂毒性导致的人冠状动脉内皮细胞损伤的研究,结果发现GLP-1的干预可通过PKA/PI3K/Akt/eNOS、p38MAPK及JNK激酶依赖的途径改善动脉内皮细胞体外的增殖、迁移及血管形成能力,并减少其凋亡。由此可见,GLP-1除了其优秀的降糖作用之外,其对保护内皮细胞、改善内皮细胞功能同样具有重要优势,而PKA/PI3K/Akt是其发挥多器官保护作用的主要上游通路。那么,在胰岛微血管内皮细胞,GLP-1对糖尿病状态下AOPPs蓄积导致的胰岛微血管内皮细胞的损伤是否也具有同样的保护作用呢?是否可通过改善胰岛微血管内皮细胞的功能进而改善胰岛微循环并最终延缓胰岛β细胞的进行性衰退呢?这些都是值得我们深入研究的重要课题。因此,探求GLP-1独立于降糖作用之外的胰岛微血管保护作用及机制,挖掘新的保护胰岛细胞功能的治疗靶标,对广大的T2DM患者来说具有十分重要的意义。本研究建立AOPP修饰的大鼠血清白蛋白(AOPP-modifiedRSAAOPP-RSA)诱导大鼠微血管内皮细胞(isletmicrovascularendothelialcells,IMECs)损伤研究模型,探讨GLP-1干预对AOPPs诱导的胰岛微血管内皮细胞凋亡、增殖、迁移以及再血管化能力损伤的保护作用及其相关机制,以期为GLP-1治疗延缓胰岛细胞功能的进行性衰竭提供新视点。目的本课题拟在建立AOPPs诱导大鼠IMECs损伤为研究模型的基础上,通过观测GLP-1干预对AOPPs诱导内皮细胞凋亡、增殖、迁移及再血管化能力的作用,并检测其对凋亡相关蛋白及PI3K/Akt/eNOS通路的影响,初步探讨GLP-1对AOPPs诱导IMECs功能紊乱的保护作用及分子机制。内容课题分以下三大部分：第一部分AOPPs对大鼠胰岛微血管内皮细胞凋亡的影响及机制目的探讨AOPPs对大鼠IMECs细胞凋亡的影响及其机制。方法1.体外制备、鉴定晚期蛋白氧化产物：将20mg/ml大鼠血清白蛋白(RSA)与等体积的40mmol/1次氯酸混合,放置30min,制备出RSA与次氯酸摩尔比为1：140的AOPP。经由无内毒素PBS透析24h,除去过多游离的次氯酸。0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。2.大鼠胰岛细胞的分离、纯化：利用胶原酶P胰管灌注结合Ficol-400密度梯度消化、分离及纯化大鼠胰岛,体外行DTZ染色、台酚蓝染色,将细胞团浓度调整为500IEQ/ml,以吸管移入细胞培养瓶内,置于34℃、5%CO2二氧化碳恒温培养箱中培养；3.磁珠纯化胰岛微血管内皮细胞(IMECs)及培养鉴定：纯化后的胰岛细胞经体外培养3-5d时可见有梭形细胞从胰岛内长出,7-9d细胞逐渐融合成片。将UEA-1包被的M-450免疫磁珠纯化后的胰岛微血管内皮细胞接种在2%明胶包被的细胞培养瓶中培养。免疫荧光检测培养皿中内皮细胞主要标志物第Ⅷ因子相关抗原(vWF)和吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)能力。4.实验分组：不同浓度AOPPs对细胞凋亡的影响：分5组,依次为正常对照组(不加任何干预剂),阴性对照组(200μg/mLRSA),100μg/mL、200μg/mL、300μg/mLAOPPs组,分别作用细胞48h。AOPPs作用不同时间对细胞凋亡的影响：分5组,依次为200μg/mLAOPPs分别作用内皮细胞0、12、24、48、72h。5.Hoechst33258及AnnexinV-FITC/PI定量分析细胞凋亡率：细胞经各组不同处理后,4%多聚甲醛于4℃处理细胞5min,Hoechst33258染色5min,封片后荧光显微镜观察细胞形态。将各组处理后细胞经胰酶消化,离心后弃上清,PBS洗涤后加入AnnexinV和碘化丙啶(P1)避光放置15min,流式细胞仪检测,CellQuest软件分析细胞早期凋亡率。6.DHE荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)：直接采用AOPPs200ug/ml干预48小时为干预条件探讨AOPPs导致IMECs细胞凋亡的机制。实验分组：空白对照组,阴性对照组(RSA200ug/ml),AOPPs200ug/ml组,AOPPs200ug/ml+apocynin(NADPH氧化酶阻断剂)组。收集各组细胞后无血清DMEM培养基洗3次,每管加入101μM的DHE工作液2.5m1重悬细胞,37℃5%CO2细胞培养箱内避光孵育40min,洗涤细胞2次。激光共聚焦显微镜观察细胞内DHE荧光分布,各组细胞随机选取3个视野对其扫描并分析相对荧光强度。7.Westernblotting检测细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达收集各组细胞,提取各组细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白质样本50μg,以12%SDS-PAGE进行电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭2h,洗膜,加入RSA-TBS稀释的抗Bcl-2单克隆抗体(1：1000),抗Bax(1:2000)单克隆抗体,4℃孵育过夜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：2000)杂交1h,ECL超敏发光液进行显色,结果用ImageJ分析软件对目的条带进行灰度值分析。8.细胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3活性的检测实验分组及干预同上。胰酶消化各组细胞,各组细胞孵育48h,消化、离心后、用细胞裂解液重悬,再加入对应的反应底物。37℃水浴2h后,加样至96孔培养板,最后用酶联免疫检测仪测OD值,检测波长为405nm。统计学处理采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-WayANOVA)检验,两两比较采用LSD法。相关分析采用Spearman相关分析法。P<0.050具有统计学意义。结果1.不同浓度AOPPs干预48h对IMECs细胞凋亡的影响100、200、300μg/mLAOPPs作用IMECs48h后,凋亡率分别为14.57±4.7,24.20±±4.30,35.53±±6.47,均显著高于空白对照组(5.87±1.51)和阴性对照组RSA(6.90±1.42)(均P<0.05)。非参数Spearman相关分析表明：AOPPs浓度(100、200、300μg/mL)与大鼠IMECs的凋亡率间存在显著正相关关系(r=0.949,P=0.000)。2.比较AOPPs不同作用时间对IMECs细胞凋亡的影响200μg/mLAOPPs作用时间(12h、24h、48h、72h)后的细胞凋亡率分别为11.61±1.94,16.69±3.17,23.48±4.69,32.80±7.13,均显著高于control组0h的凋亡率(6.10±2.07)(F=17.854,P=0.000)。非参数Spearman相关分析表明：AOPPs作用时间与细胞凋亡率值与存在显著正相关关系(r=0.950,P=0.000)。3.AOPPs(200μg/mL)干预48h对IMECs细胞内活性氧的影响IMECs阴性对照组(RSA对照)荧光值为27.49±±4.75,给予AOPPs200ug/ml作用48h后荧光值为58.43±2.71,显著高于对照组(P=0.000),提示AOPPs刺激内皮细胞ROS生成增加。在给予NADPH氧化酶抑制剂apocynin后,细胞内ROS荧光度值显著降低(30.45±4.35),与AOPPs200ug/ml组相比具有统计学差异(P=0.000)4.AOPPs(200μg/mL)干预48h对IMECs细胞凋亡蛋白Bc1-2、Bax表达的影响各组细胞经干预48h后,细胞Bcl-2蛋白的表达具有统计学差异(F=4.675,P=0.036)。其中AOPPs200ug/ml组可显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达量(0.60±0.09),明显低于RSA对照组(P=0.021)。给予NADPH氧化酶抑制剂apocynin后Bcl-2表达量则显著升高(0.87±0.14),与单独AOPPs干预组相比具有统计学差异(P=0.033)。AOPPs200ug/ml干预组显著升高了Bax蛋白表达量(1.35±0.19),与RSA对照相比具有统计学差异(P=0.008)。给予apocynin干预后Bax表达量则显著降低(0.97±0.15),与单独AOPPs干预组相比具有统计学差异(P=0.021)。5.AOPPs(200μg/mL)干预48h对细胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3活性的影响各组IMECs在干预48h后,细胞中caspase-9、-3活性各组细胞之间具有统计学差异(F分别为144.224和311.617,均P=0.000)。AOPPs作用IMECs细胞48h后,细胞中caspase-9、-3活性(分别为1.244±0.08,1.01±0.04)显著高于其空白对照及RSA阴性对照组(均P<0.05),apocynin提前预处理组细胞中caspase-9、-3活性则显著降低(分别为0.45±0.06,0.40±±0.04)与单独AOPPs干预组相比差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论AOPPs可呈剂量、时间依赖性诱导胰岛微血管内皮细胞凋亡。AOPPs作用于IMECs细胞48h后,可显著增加细胞内ROS水平、促凋亡蛋白Bax表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达,同时增强凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性。而NADPH氧化酶阻断剂Apocynin可阻断AOPPs这一系列效应。因此推测AOPPs可能主要通过NADPH氧化酶途径增加细胞内活性氧水平加剧细胞内氧化应激损伤,进而通过对凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达、caspase-9、-3活性的调控诱导IMECs细胞的凋亡。第二部分AOPPs对大鼠胰岛微血管内皮细胞增殖、迁移及再血管化功能的影响及机制目的研究AOPPs对IMECs细胞增殖、迁移及再血管化功能的的影响,进而探明AOPPs在胰岛微血管内皮细胞损伤及功能紊乱中的作用及机制。方法1.实验分组：不同浓度AOPPs对细胞增殖、迁移及血管化功能的影响：分6组,依次为空白对照组、阴性对照组(200μg/mLRSA)、AOPPs100μg/mL、300μg/mL组以及AOPPs200μg/ml+NADPH氧化酶抑制剂组(Apocynin)。观察细胞迁移能力时为排除细胞凋亡影响我们选取干预时间为24h,而观察细胞增殖能力及血管化能力时则选取干预时间为48h。AOPPs200μg/mL不同作用时间对细胞增殖活性的影响：分5组,依次为200μg/mLAOPPs分别作用内皮细胞0、12、24、48、72h。2.CCK-8检测细胞增殖活性96孔板铺板细胞,分组如上所示,在各组干预不同时间,每孔加入cck-8(cellcountingkit-8细胞计数试剂)溶液10ul,37℃,5%C02培养箱避光孵育1小时,酶标仪450nm波长处读取吸光度值,反映细胞的增殖活性。3.Transwell小室检测AOPPs对IMECs细胞体外迁移能力的影响各组细胞撤血清饥饿12-24h,调整细胞密度至1×105,上室分别加入胰岛微血管内皮细胞悬液200μ1、RSA、不同浓度的AOPPs(100μg/mL、200μg/mL300μg/mL)以及apocynin,下室加人600μl含10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃培养24小时,固定染色并计数,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞。4.Matrigel基质胶中检测AOPPs对IMECs再血管化能力的影响将缺乏生长因子的高浓度Matrigel基质胶在冰上过夜融化,均匀铺于无菌的96孔板上(70μL/孔),放于温箱中30min成胶。将5000大鼠胰岛微血管内皮细胞用无血清培养液种植于每孔中,分别加入RSA、不同浓度的AOPPs(100μg/mL,200μg/mL,300μg/mL)以及apocynin。置于37℃、C02培养箱中作用48小时,低倍镜下倒置显微镜照相,每孔随机取3个视野。5.AOPPs对胰岛微血管内皮细胞NADPH氧化酶活性的影响各组细胞干预48h后制备细胞匀浆,测定细胞匀浆蛋白含量,将各组100μg细胞蛋白加至96孔测量板中,各孔加入暗适应的光泽精5μM及底物NADPH100μM。用VICTOR1420多标记分析系统动态检测各组NADPH依赖的02-产生的荧光量,间接反映02-的产量及NADPH氧化酶活性。所测得的数据用“CPS”表示,即每秒通过光子数：countspersecond.6.Westernblotting法检测AOPPs对IMECs细胞p-Akt、p-eNOS的表达取同步生长的胰岛微血管内皮细胞,依次给予阴性对照组(200μg/mLRSA)、AOPPs100μg/mL、AOPPs200μg/mL、AOPPs300μg/mL以及Apocynin干预,作用时间为48小时。具体实验步骤和方法同第一部分。7.AOPPs对胰岛微血管内皮细胞NO水平的影响按照碧云天生物科技公司一氧化氮检测试剂盒的标准操作流程测定细胞内NO的水平,DMEM10%FBS稀释标准品,在96孔板中加入50μl/孔的标准品及细胞培养液上清,依次在各孔中加入室温GriessReagentI,GriessReagentII,540nm测定吸光度。统计学处理采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-WayANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P<0.050具有统计学意义。结果1.不同浓度AOPPs对IMECs细胞增殖活力的影响100、200、300μg/mLAOPPs作用IMECs48h后,OD值分别为1.02±0.06,0.75±0.07,0.55±0.08,均显著低于RSA阴性对照组(1.29±0.08),P=0.000。200μg/mLAOPPs在给予NADPH氧化酶阻断剂apocynin预处理后细胞活力显著增加为(1.22±0.12),与单独AOPPs处理组相比差异具有统计学意义(均P<0.05)。AOPPs的浓度(100,200,300μg/mL)与IMECs的OD值存在显著负相关关系(r=-0.949,P=0.000)。2.比较AOPPs不同作用时间对细胞增殖活力的影响200μg/mLAOPPs作用时间(12h、24h、48h、72h)后的细胞OD值分别为1.11±0.08,0.96±0.07,0.75±0.07,0.53±0.11,均显著低于control组的OD值(1.29±0.08)(vs.control,P=0.000).AOPPs作用时间与细胞活力间存在显著负相关关系(r=-0.972,P=0.000)。3.AOPPs对胰岛微血管内皮细胞迁移能力的影响AOPPs100、200、300μg/mLAOPPs作用IMECs24h后,其穿透至下室的细胞数量分别为266.00±11.14,184.00±9.17,135.00±10.44,均显著低于空白对照、RSA阴性对照组(P=0.000)。Apocynin预处理组穿透至下室的细胞数量明显增加(305.67±12.22),与单独AOPPs处理组相比差异具有统计学意义(均P<0.05)。AOPPs的浓度(100、200、300μg/mL)与IMECs迁移能力存在显著负相关关系(r=-0.972,P=0.000)。4.AOPPs对IMECs细胞Matrigel基质中形成三维结构能力的影响AOPPs100、200、300μg/mLAOPPs作用IMECs48h后,细胞在Matrigel基质胶中形成三维结构的数量分别为7.33±0.58,5.67±0.57,3.33±0.57,均显著低于空白对照、RSA阴性对照组(均P<0.05)。Apocynin预处理组形成三维结构的数量明显增加(9.33±1.53),与单独AOPPs处理组相比差异具有统计学意义(均P<0.05)。AOPPs的浓度(100、200、300μg/mL)与IMECs的迁移能力存在显著负相关关系(r=-0.978,P7=0.000)。5.AOPPs对胰岛微血管内皮细胞NADPH氧化酶活性的影响随着AOPPs浓度的增加,NADPH依赖性的02-的产量逐渐增强,300μg/ml时达高峰。AOPPs(100、200、300μg/mL)干预组与空白对照、RSA阴性对照及apocynin阻断剂组相比具有统计学差异(F=59.389,P=0.000)=AOPPs的浓度(100、200、300μg/mL)与NADPH氧化酶活性存在显著负相关关系(r=-0.949,P7=0.000)。6.AOPPs对IMECs中p-Akt、p-eNOS表达的影响各组间p-Akt、p-eNOS的表达具有统计学差异(F=32.631,P=0.000)和(F=21.791,P=0.000).p-Akt、p-eNOS的表达随AOPPs干预浓度的增加而显著降低,与RSA对照组相比具有统计学差异(均P<0.05)。而在给予NADPH氧化酶阻断剂apocynin后二者表达量显著增加,与无apocynin干预组相比具有统计学差异。AOPPs的浓度(100,200,300μg/mL)与p-Akt、p-eNOS表达存在显著负相关关系(r=-0.949,P=0.000)和(r=-0.926,P=0.000)。7.AOPPs对胰岛微血管内皮细胞内NO水平的影响各处理组细胞内NO水平具有统计学差异(F=27.649,P=0.000),其中AOPPs(100,200,300μg/mL)干预后细胞内NO水平显著降低,分别为15.13±1.48,12.14±1.44,8.87±1.74,与空白对照(19.56±0.81)及RSA对照(18.64±1.36)相比具有统计学差异(均P<0.05)。给予Apocynin预处理的细胞内NO水平则显著增加为(17.89±1.25),与单独AOPPs干预相比差异具有统计学意义。AOPPs的浓度(100,200,300μg/mL)与IMECs的细胞内NO水平存在显著负相关关系(r=-0.896,P=0.000)。结论AOPPs干预可显著降低胰岛微血管内皮细胞增殖能力、迁移能力及再血管化能力,增强了细胞内NADPH氧化酶的活性,显著降低了细胞内磷酸化Akt及eNOS的表达水平以及细胞内NO的水平。我们推测：一方面AOPPs可通过下调PI3K/Akt通路中磷酸化Akt及eNOS的表达水平,减少细胞NO的水平；另一方面可通过增强NADPH氧化酶活性加强了NADPH氧化酶介导的eNOS脱偶联导致细胞内NO水平的下降。细胞内NO水平的降低最终导致胰岛微血管内皮细胞的损伤及功能紊乱。第三部分GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞损伤及功能紊乱的保护作用及机制目的研究GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞凋亡、增殖、迁移及再血管化能力的保护作用及其对PI3K/Akt及其下游分子信号通路的影响。方法1.实验分组分4组,依次为阴性对照组(200μg/mLRSA)、AOPPs200μg/mL、AOPPs200μg/mL+100nmol/LGLP-1组、AOPPs200μg/mL+100nmol/LGLP-1+10μmol/LLY294002组(P13K特异性抑制剂LY294002预处理1h后方加入AOPP-RSA和GLP-1)。用无血清培养基稀释各种药物储存液,作用一定时间后收集各组细胞。其中观察细胞迁移能力时为排除细胞凋亡影响我们选取干预时间为24h,而观察细胞凋亡、增殖能力及血管化能力时则选取干预时间为48h。2.AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡(方法同第一部分)3.CCK-8检测细胞增殖活性(方法同第二部分)4.Transwell小室检测GLP-1对AOPPs诱导的IMECs体外迁移能力方法同第二部分5.Matrigel基质胶中检测GLP-1对AOPPs诱导的IMECs再血管化能力的影响(方法同第二部分)6.DHE荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)(方法同第一部分)7.Westernblotting法检测IMECs细胞RAGE、Bc1-2、Bax、p-Akt,p-eNOS蛋白的表达(方法同第一、二部分)8.GLP-1对胰岛微血管内皮细胞内NO水平的影响(方法同第二部分)统计学处理采用SPSS13.0进行统计分析,计量实验数据以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-WayANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P<0.050具有统计学意义。结果1.GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞凋亡的影响各处理组间IMECs细胞的凋亡率有显著差异(F=43.433,P=0.000)。200μg/mLAOPPs作用IMECs48h后,凋亡率为25.05±3.46,显著高于RSA对照组8.57±0.86(P<0.05)。在给予GLP-1(100nmol/L)后细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。而提前给予PI3K抑制剂LY294002预处理后再给予AOPPs及GLP-1干预的细胞组其细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。2.GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞增值活性的影响AOPPs200μg/mL诱导胰岛微血管内皮细胞48h后的OD值为0.65±0.08,与RSA对照组相比,有显著差异(P=0.000)。给予GLP-1联合处理组的细胞OD值为1.13±0.14,显著高于AOPPs单独干预组(P=0.001)。LY294002预处理组的OD值为0.72±0.10,与AOPPs+GLP-1组相比显著降低(P=0.001),LY294002预处理可部分阻断GLP-1恢复细胞活力的效应。3.GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞迁移能力的影响在给予AOPPs200μg/mL刺激24小时后,由Transwell上室穿透至下室的细胞数量显著减少196.33±15.50,与RSA对照组(306.00±13.11)相比具有统计学差异(P<0.05)。在给予GLP-1(100nmol/L)后发生迁移的细胞数量显著增加(296.67±17.62)(P<0.05)。而提前给予PI3K抑制剂LY294002预处理后再给予AOPPs及GLP-1干预的细胞组其迁移细胞率则显著减少(216.00±21.07)(P<0.05)。4.GLP-1对AOPPs诱导的IMECs在Matrigel基质中形成三维结构的影响AOPPs200μg/mL干预48小时组细胞形成三维结构的数量(4.67±0.58)与RSA阴性对照(9.33±0.58)相比显著减少,差异具有统计学意义(P=0.000)。在给予GLP-1(100nmol/L)后形成三维结构的数量显著增加(8.00±1.00)(P<0.05)。而提前给予PI3K抑制剂LY294002预处理后再给予AOPPs及GLP-1干预的细胞形成三维结构的数量则未见显著增加(6.00±1.00)(P<0.05)。5.GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞NADPH氧化酶活性的影响AOPPs200μg/mL显著增加胰岛微血管内皮细胞NADPH依赖性的O2-的产量(367.67±21.94),与RSA对照组相比,有显著差异(P=0.000)。给予GLP-1联合处理后NADPH依赖性的O2-的产量显著减少(158.00±13.00),差异具有统计学意义。LY294002预处理组其细胞NADPH依赖性的O2-的产量与单独给予GLP-1干预组相比又显著增加(348.33±18.23),P<0.05。6.GLP-1对AOPPs诱导的对IMECs内活性氧(ROS)的影响AOPPs显著增加了细胞内ROS的水平,其荧光强度为(53.85±4.15)与RSA对照相比(24.37±2.84)具有统计学差异(P=0.000)。GLP-1(100nmol/L)干预组细胞内ROS水平显著下降为(30.02±5.12),而提前给予LY294002预处理组细胞内ROS水平又显著升高(48.65±6.31),均P<0.05。7.GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞RAGE表达的影响RSA对照组其蛋白水平为(0.33±0.05),AOPPs干预后显著增加了细胞RAGE表达的水平(0.60±0.09)与RSA对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。GLP-1(100nmol/L)干预可显著下调细胞RAGE表达水平(0.37±0.06)(P=0.004),而提前给予LY294002预处理并不能阻断GLP-1下调RAGE表达的作用(0.39±0.08),均P>0.05。8.GLP-1对AOPPs诱导的IMECsf中bcl-2、Bax、p-Akt、p-eNOS的表达AOPPs200μg/mL干预显著降低了抗凋亡蛋白bcl-2、p-Akt、p-eNOS的表达,而增加了促凋亡蛋白Bax蛋白的表达,与RSA对照组相比差异具有统计学意义(均P<0.05)。GLP-1干预后可显著增加bcl-2、p-Akt、p-eNOS表达而降低Bax表达(均P<0.05)。LY294002预处理可显著抑制GLP-1介导的bcl-2、p-Akt、p-eNOS的表达增加以及Bax表达降低(均P<0.05)。9.GLP-1对AOPPs诱导的IMECs细胞内NO水平的影响AOPPs200μg/mL干预组显著降低了细胞内NO的水平(10.05±1.67),与RSA对照组(18.85±1.87)相比具有统计学差异,P<0.05。GLP-1(100nmol/L)干预后显著升高了细胞内NO的水平(17.35±1.39),与单纯AOPPs干预组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。而PI3K抑制剂LY294002的预处理则显著削弱了GLP-1的这一保护性调节作用,而使细胞内NO的水平显著降低(10.93±1.45)。结论本部分实验首次证明GLP-1可降低AOPPs导致的胰岛微血管内皮细胞的凋亡,显著改善被AOPPs损伤的胰岛微血管内皮细胞的增殖、迁移及再血管化能力。GLP-1改善胰岛微血管内皮细胞功能损伤及紊乱的作用主要通过以下两方面途径来完成：一是通过下调RAGE受体表达、抑制NADPH氧化酶活性、减少细胞内活性氧而改善了氧化应激损伤及NADPH氧化酶介导的eNOS脱偶联,升高了细胞内NO的水平；二是激活PI3K/Akt信号转导通路,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,减低促凋亡蛋白Bax表达,增加磷酸化内皮型一氧化氮合成酶(p-eNOS)表达升高细胞内NO水平,最终减少内皮细胞凋亡并改善内皮细胞功能紊乱。
【作者】张振；
【导师】蔡德鸿；
【作者基本信息】南方医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】晚期蛋白氧化产物；胰高血糖素样肽-1；胰岛微血管内皮细胞；凋亡；增殖；迁移；PI3K/Akt；

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