川芎嗪对肺动脉高压影响的实验与临床研究

【摘要】研究背景：肺动脉高压是一种临床上比较常见的心血管疾病,本病以肺血管阻力进行性升高为特征,病理学以肺小动脉痉挛、内膜增生及重构和原位微血栓病灶形成为主要特征。其诊断标准：静息状态下心导管测定平均肺动脉压≥25mmHg或者运动时≥30mmHg,且肺毛细血管压或者左房压<15mmHg。根据指南的最新分类方法,肺动脉高压分为五大类：1.动脉型肺动脉高压；2.静脉性肺动脉高压；3.低氧血症相关性肺动脉高压；4.慢性血栓或栓塞所致肺动脉高压；5.混合性肺动脉高压。本病致死、致残率高,严重威胁人民健康及生命,是医学研究的热点方向之一。其中,流行病学调查发现,动脉型肺动脉高压(以下称“肺动脉高压”)和慢性血栓和／或栓塞性疾病所引起的肺动脉高压是本病中危害我国人民身体健康最严重的类型,是引起患者致死的重要原因。根据美国国立卫生院注册研究表明肺动脉高压患者的中位生存期为2.8年、1年、3年和5年的生存率分别为68%、48%和34%,而在我国特发性肺动脉高压和家族性肺动脉高压患者1、2、3、5年的生存率分别为68%、56.9%、38.9%及20.8%。肺小动脉血管增生、重构导致肺血管阻力进行性加重,最终引起右心室功能衰竭、死亡,这是本病的主要致死原因。以往,由于肺动脉高压的发病机理未明,传统治疗仅仅在于限制体力活动、吸氧、抗凝、利尿、强心,钙离子拮抗剂等一般处理,但在临床上这些治疗的效果往往不佳,本病的治疗曾一度停滞不前。随着发病机理研究的进展,新型靶向治疗药物不断面世,目前公认较为有效的靶向治疗药物包括：前列环素类(伊洛前列环素)、内皮素受体拮抗剂(波生坦)、5-磷酸二酯酶抑制剂(西地那非)。循证医学研究表明,上述靶向治疗药物能使肺动脉高压患者的心功能、生活质量有了很大的改善,甚至提高了生存率。由此,美国FDA批准上述药物用于治疗肺动脉高压,使许多原本绝望的患者看到再生的希望。然而,上述药物仅能改善患者临床症状与血流动力学状况,单纯扩血管的作用有限,不能减缓肺动脉压力进行性升高的趋势,病情仅仅是延迟加重,并没有根治。肺动脉高压患者肺动脉压力不断升高的原因,在于肺血管重构；而肺血管重构的基础是血管平滑肌细胞的过度增殖。因此,抑制血管平滑肌细胞增殖、促进其凋亡是肺动脉高压治疗领域的发展趋势之一。与此同时,上述药物完全依靠进口,价格昂贵,例如其中费用最低的西地那非,每月的费用需数千元,而我国实行基本药物医疗保障制度,上述药物均未能列入国家基本医疗保险药品目录,患者需自行承担所有费用,致使我国许多患者未能得到有效的治疗。基于上述原因,寻找能够抑制甚至逆转肺血管重构、改善右室心功能且价格低廉的药物具有十分重要的意义,也更适合我国的国情。川芎嗪是中药川芎的有效成分,新近研究表明它有抗血小板、刺激NO生成、扩张血管、抗炎、抗肿瘤细胞增生等作用,与肺动脉高压的治疗有相符的地方。目前国内已经有临床研究应用川芎嗪干预由肺心病引起的低氧性肺动脉高压,结果提示川芎嗪能降低肺动脉压,提高血氧浓度,改善患者生活质量,研究显示监测的指标反应ET-1下降,NO升高,推测川芎嗪通过提高肺血管内皮NO释放达到治疗肺动脉高压,同时试验表明药物是安全的。为探讨川芎嗪对动脉型肺动脉高压、慢性血栓或栓塞性疾病所引起的肺动脉高压患者是否具有治疗作用而设计本研究。如能证实川芎嗪对肺动脉高压有治疗作用,可以为肺动脉高压的治疗提供更多的选择。本研究分为动物基础研究及临床研究两部分,研究获得单位所在伦理委员会通过。根据伦理委员会的意见,临床研究部分不设空白对照组。第一章川芎嗪对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响目的：通过使用川芎嗪对野百合碱(MCT)诱导的大鼠肺动脉高压进行干预,观察川芎嗪对大鼠肺动脉压力及肺血管重构的影响,并初步探讨其作用的可能机制。方法：1.造模：实验动物为SD大鼠,成年,雄性共30只,随机分为对照组、MCT诱导的肺动脉高压组(MCT组)、川芎嗪治疗组(治疗组)。MCT组(10只)：次皮下注射野百合碱(50mg/kg)饲养21天后,再以生理盐水(2ml/d)每日灌胃一次,共20天；对照组(10只)：一次皮下注射等量生理盐水饲养21天后,再以生理盐水(2ml/d)每日灌胃一次,共20天；治疗组(10只)：一次皮下注射野百合碱(50mg/kg),饲养21天后,以川芎嗪(80mg/(kg.d))每日灌胃一次,共20天。2.主要检测指标：平均肺动脉压力(meanpulmonaryarterialpressure,mPAP),右心室肥大指数(rightventricularhypertrophyindex.RVHI),血管周围炎症评分,肺动脉中膜厚度百分比(WT%),肺组织PCNA、α-SMA及NF-κB的表达。3.统计学方法：使用SPSS13.0软件。三组数据的组间比较,采用单向方差分析(one-wayANOVA)进行统计分析,方差齐：多个样本均数方差间比较采用最小显著差值法(LSD法)进行各组间数据的两两比较；方差不齐：多个样本均数方差间比较采用Tamhane检验法；指标间相关关系采用Pearson或Spearman相关分析法,以P<0.05为有统计学差异。结果：大鼠死亡情况：实验进行到第22、25天,MCT组死亡大鼠各一只,实验进行到第27天治疗组死亡大鼠一只,对照组大鼠全部生存。大鼠死亡前表现为呼吸困难。最终MCT组成模8只,治疗组成模9只,对照组10只。1.川芎嗪对肺动脉高压大鼠mPAP以及RVHI的影响：MCT组大鼠的mPAP和RVHI均显著高于对照组(P<0.01),而治疗组大鼠的mPAP和RVHI均较MCT组明显降低(P<0.01),治疗组、对照组大鼠的mPAP和RVHI比较无差别(P>0.05)。2.川芎嗪对肺血管周围炎症评分的影响：MCT组大鼠肺组织病理切片提示,血管周围炎症评分平均为3.5分,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)；治疗组肺血管炎症程度评分明显降低,与MCT组比较差异有显著性(P<0.01)；治疗组、对照组组间比较无显著性差异(P=0.75)。3.川芎嗪对肺动脉高压大鼠肺中动脉肺动脉中膜厚度百分比(WT%)的影响：MCT组WT%大于对照组,P<0.01；治疗组WT%小于MCT组P<0.01；治疗组WT%大于对照组P<0.01。4.川芎嗪对肺动脉高压大鼠肺中小动脉PCNA表达的影响：MCT组PCNA表达大于对照组,P<0.01；治疗组PCNA表达小于MCT组P<0.01；治疗组PCNA表达大于对照组P<0.01。5.川芎嗪对肺动脉高压大鼠肺小动脉a-SMA表达的影响：MCT组可见大鼠肺小动脉α-SMA表达明显增强,中膜增厚显著；对照组小动脉未见明显a-SMA表达;治疗组小动脉可见少量a-SMA表达。6.川芎嗪对肺动脉高压大鼠肺组织NF-κB表达的影响：MCT组大鼠细支气管上皮细胞胞核阳性表达率较对照组明显增加(P<0.01)；治疗组大鼠细支气管上皮细胞胞核阳性表达率较MCT组少(P<0.01),较对照组多(P<0.01)。7.大鼠PCNA表达与肺动脉中膜厚度指标的相关性：大鼠PCNA的表达与肺动脉中膜厚度百分比(WT%)呈正相关,r=0.96,P<0.01。8.大鼠NF-κB表达与炎症及肺动脉中膜厚度指标的相关性：大鼠NF-κB表达与肺小动脉周围炎症呈正相关,r=0.73,P<0.01；大鼠NF-κB表达与炎症及肺动脉中膜厚度百分比呈正相关,r=0.94,P<0.01。结论：1.平均肺动脉压力增高时大鼠肺动脉中膜厚度百分比(WT%)、肺组织PCNA、α-SMA及NF-κB的表达均增高,大鼠PCNA、NF-κB表达与肺动脉中膜厚度呈正相关,提示大鼠肺动脉高压的肺血管重构可能与肺动脉平滑肌细胞过度增殖有关；2.肺动脉高压时肺血管周围炎症严重,提示炎症可能参与影响肺动脉压力；3.川芎嗪的干预可以降低大鼠平均肺动脉压、肺动脉中膜厚度百分比(WT%)、肺组织PCNA、α-SMA及NF-κB的表达,同时可以减轻肺血管周围炎症,提示川芎嗪对大鼠肺动脉高压有治疗作用；4.川芎嗪降低大鼠平均肺动脉压力的机制可能与抑制肺动脉平滑肌细胞增殖,改善肺血管重构,以及减轻肺血管周围炎症有关。第二章川芎嗪联合西地那非对肺动脉高压的临床研究目的：通过对肺动脉高压患者进行西地那非单药治疗与川芎嗪联合西地那非联合治疗进行对比,观察联合治疗组疗效是否优于西地那非单药组。方法：1.研究对象：符合入选标准的肺动脉高压患者：年龄在18-65岁之间的特发性肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压、家族性肺动脉高压患者；基线6分钟步行距离≥100m且≤500m。共32例,男23例,女9例。WHO肺动脉高压功能分级为Ⅱ级；NYHA心功能分级为Ⅲ、Ⅳ级；急性血管反应试验阴性,且未接受内皮素受体拮抗剂、前列环素类药物、治疗。2.分组及治疗方法：本研究为前瞻性、开放性、非空白对照研究。按患者是否接受川芎嗪治疗分为2组：西地那非组(18例)、西地那非±川芎嗪联合用药组(联合用药组,14例)。用药方法：两组均口服西地那非,一次25mg,餐前1小时口服,一日3次；联合用药组在口服西地那非基础上加用磷酸川芎嗪片,一次100mg餐前1小时口服,一日3次。疗程：12周,每2周门诊随访。两组患者基线资料的比较无统计学差异。3.疗效评价指标：①主要评价指标：6分钟步行距离(6-minutewalktest,6MWT);②次要评价指标：WHO肺动脉高压功能分级、Borg呼吸困难评级、平均肺动脉压力(mPAP)。4.统计学方法：使用SPSS13.0软件进行统计学分析。6分钟步行距离、血流动力学指标采用均数±标准差(x±s)表示,同组治疗前后用配对t检验进行分析,2组间均数比较用独立样本t检验进行分析。Borg呼吸困难评级、WHO肺动脉高压功能分级的比较,同组治疗前后用非参数配对秩和检验(Wilcoxon符号秩和检验)进行分析,2组间比较用两独立样本非参数检验(Mann-WhitneyU)进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1.各药物治疗组指标前、后的变化：西地那非组：治疗后6分钟步行距离比治疗前增加45米,P<0.01,差异有统计学意义；治疗后平均肺动脉压比治疗前下降约13mmHg,P<0.01,差异有统计学意义；治疗后WHO肺动脉高压功能分级下降,P=0.002,差异有统计学意义；Borg呼吸困难评级下降,P=0.007,差异有统计学意义。联合治疗组：治疗后6分钟步行距离增加57米,P<0.01,差异有统计学意义；治疗后平均肺动脉压下降约25mmHg,P<0.01,差异有统计学意义；WHO肺动脉高压功能分级下降,P=0.001,差异有统计学意义；Borg呼吸困难评级下降,P=0.001,差异有统计学意义。2.两组治疗后指标差异的比较：6分钟步行距离：西地那非组小于联合治疗组,两者差异有统计学意义,P=0.046；平均肺动脉压：西地那非组高于联合治疗组治疗,差异有统计学意义,P=0.039；WHO肺动脉高压功能：联合治疗组下降更明显,差别有统计学意义,P=0.038；Borg呼吸困难评级：联合治疗组下降更低,差别有统计学意义,P=0.017。结论：1.西地那非干预后患者症状改善,平均肺动脉压力下降,6分钟步行距离增加,WHO肺动脉高压功能、Borg呼吸困难评级均改善,无严重不良反应,说明西地那非治疗肺动脉高压安全、有效,与以往研究结果相同,在伦理委员会不建议设置空白对照组的建议下,治疗效果有效且安全的西地那非作为非空白对照组是有意义的选择。2.在使用西地那非的基础上,加用川芎嗪治疗后,患者平均肺动脉压力、6分钟步行距离、WHO肺动脉高压功能、Borg呼吸困难评级等指标的改善情况比单用西地那非更明显,同时加用川芎嗪治疗后,不良反应并未增加,提示川芎嗪对肺动脉高压具有治疗作用且安全性高,这为今后进一步的研究中选择川芎嗪单药治疗提供依据。3.由于既往缺乏川芎嗪单药治疗肺动脉高压的研究,出于伦理方面的原因,本研究没有设置川芎嗪单药治疗组是一种不足。而本次临床研究结果提示川芎嗪对肺动脉高压患者的症状及观察指标均有明显的改善,同时安全性也得到验证。由此推测,川芎嗪可能成为治疗肺动脉高压的一种有效而廉价的选择,值得我们作更进一步的研究。
【作者】高汉华；
【导师】刘映峰；
【作者基本信息】南方医科大学，临床医学（专业学位），2014，博士
【关键词】平均肺动脉压；右心室肥大指数；PCNA；α-SMA；NF-κB；肺动脉高压；6分钟步行距离；WHO肺动脉高压功能；Borg呼吸困难评级；

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