登革Ⅱ型病毒EDⅢ与登革病毒受体蛋白的鉴定及功能评价

【摘要】登革病毒(denguevirus,DENV)属黄病毒科,黄病毒属(Flaviviridae),以蚊虫作为传播的中间宿主,通过叮咬人引起和传播登革热,其中以出现登革出血热／登革休克综合征(denguehemorrhagicfever/dengueshocksyndrome,DHF/DSS)更为严重。全球每年约有3亿以上人口受威胁,约50万人可出现症状,感染个体中死亡率为1-5%,儿童患者居多。近年来,由于受到全球气候变暖、生态环境恶化、人口移动频率的增加,使得蚊媒传播区域有扩散的趋势,加剧了登革热流行的范围和频率。在我国的海南、广东、广西、福建等地也多次出现过登革热的暴发流行。世界卫生组织将DHF/DSS列为全球性公共卫生问题之一。疫苗接种是预防传染性疾病的一种既经济又有效的预防和控制手段。虽然登革疫苗的研究已有五十多年的历史,但是登革热疫苗的研发面临着严峻的挑战：(1)登革病毒血清型多,因而需要研制能对4种血清型DENV的感染同时提供保护作用的四价疫苗；(2)登革疫苗要能提供长期的保护。有研究报道,初次感染20年以后的再感染时仍会发生DHF。(3)还没有合适的复制登革疾病的动物模型；(4)尽管中和抗体的保护性作用已广为接受,但其与实际保护效果的关系仍需确定；(5)在DENV的传播模式和病毒株改变时,登革疫苗需要重新评价。因此,要研制出可靠的登革疫苗,就要解决两方面的难题：一是疫苗的效果,主要指疫苗的保护性；二是疫苗的安全性问题。鉴于这种现状,对DENV的潜在致病机理进行深入研究,并从中发掘有效的靶分子是媒介传播病毒学研究的当务之急。病毒通过与易感的宿主细胞表面受体分子结合后经介导的内吞作用侵染细胞,在胞内内质网完成一系列的复制、翻译、组装、增殖及释放的过程。而病毒与宿主细胞表面受体分子的结合是发生病毒侵染细胞的先行条件,病毒在受体的介导下最终进入宿主细胞,从而出现一系列反应。鉴于此,我们的研究方向从病原学方面,以及易感宿主细胞膜受体来探索潜在的靶分子。对登革病毒结构的认识,目前认为DENV是单股正链RNA病毒,基因组RNA约含有llkb核苷酸。基因组存在一个开放读码框,其5’端编码三种结构蛋白(C、M/prM和E),3’端编码七个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2BNS3、NS4A、NS4B、NS5)。E蛋白是结构蛋白中主要的包膜糖蛋白,是由两个单聚体组成的分子量约55-60kDa的同源二聚体,这种表面结构蛋白是登革病毒进入宿主细胞的一个重要靶点。结晶学对登革病毒的深入研究结果进一步发现,登革病毒包膜糖蛋白E有3个结构域(Ⅰ-Ⅲ)：第一结构域位于中心的β桶状结构、第二结构域则包含内融合肽,决定二聚体的形成。第三结构域折叠为免疫球蛋白样,是结构相对独立的受体结合区,垂直伸出病毒表面形成突起,包含能诱导产生特异性中和抗体的型和亚型抗原表位,是病毒与受体结合的主要部位。因此对第三结构域的研究成为登革病毒疫苗、病毒与宿主细胞受体相互作用的重要靶点。通过对登革II型病毒E蛋白第三结构域的生物信息学分析显示,其相对分子量为10790.5,属于稳定蛋白。从登革病毒的RNA病毒全长,到主要表面结构蛋白E蛋白,再到E蛋白的第三结构域,一是使得我们的研究范围能不断聚焦至目标靶分子,二是利用截短的病毒受体功能区有助于提高病毒受体筛选的成功率和准确性。对于登革病毒受体的研究一直广受重视。这种典型的蚊媒病毒能够感染,不同组织来源的多种细胞。由于病毒与受体结合步骤多且过程复杂,涉及不同的病毒吸附蛋白及多个靶细胞受体,登革病毒不同的血清型在同一细胞上的受体也会不一样；甚至同一种病毒在同一细胞上的受体也有可能不一样的情况发生。受体从功能上可以大致分为两类：一种是氨基聚糖类,如带高电荷的硫酸乙酰肝素,神经酰胺,可以作为受体与所有四型登革病毒E蛋白结合。是吸附病毒的始动因子,引起病毒颗粒的聚集和浓度的升高；另外一种则是相对分子质量大小不同的蛋白质,对这些蛋白质的研究成为一个重点。本研究采用广泛应用于病毒增殖及疫苗研究的BHK-21细胞(BabyHamsterSyrianKindey)模型来寻找潜在靶分子。BHK-21细胞是乳仓鼠肾细胞,是具有贴壁依赖性的成纤维细胞,经传代后细胞可悬浮生长,对登革病毒易感。由其易感性推断细胞膜上可能存在着介导DENV感染的受体。对于BHK-21细胞受体的报导,发现其氨基聚糖类受体可以与登革病毒四型血清型相结合,而对于其蛋白质受体方面尚未见报导。因此筛选与鉴定BHK-21细胞膜上的DENV受体,对研究DENV的致病机理、研制抗病毒药物等均具有潜在的应用价值。对于DENV受体及潜在的连接分子的研究方法有很多,病毒铺覆蛋白印迹技术(Virusoverlayproteinbindingassay,VOPBA),是目前比较常用的一种病毒受体筛选技术,在Westernblot的基础上,将细胞膜蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,然后加入登革病毒进行孵育,利用病毒颗粒与受体蛋白能够进行特异性结合的原理,来分离出细胞膜上的病毒受体。采用这种方法,已经成功地从白纹伊蚊的胚胎期分离出的C6/36细胞中发现分子量为40kDa和45kDa的糖蛋白、微管样蛋白、层粘连蛋白、热休克蛋白等系列受体蛋白；同时也从人的细胞如毛细血管内皮细胞(vascularendothelialcells,VECs)s肝细胞以及单核／巨噬细胞、树突状细胞等寻找到相关受体。通过对DENV-2EDⅢ蛋白在大肠杆菌内进行原核表达并纯化之后免疫家兔,收获免疫抗血清并评价其功能。利用建立好的VOPBA技术,以乳仓鼠肾细胞(BabyHamsterSyrianKindey)BHK-21细胞系为靶细胞进行DENV蛋白质受体的筛选工作,采用一维电泳结合VOPBA技术进行初步筛选,然后用二维电泳结合VOPBA进一步筛选潜在靶分子,对筛选到的潜在靶分子进行质谱分析,同时利用生物信息学的技术模拟筛选到的潜在蛋白与DENV-2EDⅢ蛋白可能的结合方式和参与结合的氨基酸残基,探讨筛选蛋白在DENV-2感染宿主细胞过程中的作用,为进一步揭示DENV的感染机制、研制特异性疫苗以及受体阻断剂类的抗病毒药物提供一定的理论基础。目的：1.从病原学方面筛选抗登革病毒潜在靶分子1.1克隆登革Ⅱ型病毒E蛋白全长基因片段,构建克隆载体pMD18-T-DV2-E质粒；1.2克隆E蛋白第三结构域基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-DV2-EDⅢ质粒；1.3诱导重组表达质粒在大肠杆菌中表达EDⅢ蛋白区域；1.4纯化重组蛋白并免疫家兔制备多克隆抗血清,评价其功能；2.从易感登革病毒的宿主细胞(BHK-21)膜受体方面筛选抗登革病毒潜在靶分子2.1一维电泳结合VOPBA法初步筛选BHK-21细胞中潜在的登革病毒连接分子；2.2二维电泳分离技术结合VOPBA,筛选特异结合分子,应用质谱分析技术分析特异蛋白,为该蛋白的功能研究做好铺垫。2.3利用生物信息学方法对筛选到的连接分子与DENV-2EDⅢ蛋白可能的结合方式和结合残基进行了预测。方法：1.用PCR从pMD18-T-DV2-E质粒上扩增出EDⅢ基因；2.通过酶切连接将EDⅢ基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化到大肠杆菌DH5a；3.将以上构建的重组表达质粒pET-32a(+)-DV2-EDⅢ转化到感受态细胞BL21(DE3),之后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用SDS-PAGE方法分析表达产物；4.IPTG诱导表达条件的优化：摸索及优化诱导的温度、时间以及IPTG使用的浓度；5.分析重组蛋白存在于上清还是沉淀物种：超声裂解表达菌,对获取的重组蛋白分析其可溶性；6.重组表达产物的免疫反应性分析：采用His-Tag单抗、DENV(1-4)单抗进行Westernblot实验,对重组蛋白的免疫反应性进行鉴定；7.提纯重组的表达产物：采取Ni-NTA初步纯化、切胶电渗二步纯化,获取高纯度产物。8.制备多克隆抗血清：将已经纯化的重组蛋白用来免疫家兔,获取多克隆抗血清；9.多克隆抗血清效价评价：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)来进行测定及分析其特异性；10.竞争性抑制实验：将纯化后的登革病毒EDⅢ纯化蛋白稀释成不同浓度,在BHK-21细胞上进行竞争性分析；阴性对照组采用不同浓度的BSA蛋白；11.多克隆抗血清效价检查采用空斑中和分析实验：将制备好的多克隆兔血清连续两倍梯度稀释后用于实验,检测其效价；12.利用BHK-21细胞繁殖登革病毒,纯化病毒并测定滴度；13.BHK-21细胞繁殖登革病毒,收集病毒液。采用单层细胞滴定法测定病毒滴度TCID50,即半数细胞培养物出现病变的最高稀释度,采用Reed-Muench法计算TCID50。14.提取BHK-21细胞的总蛋白,并进一步分离出膜蛋白。通过SDS-PAGE分离蛋白,结和病毒结合实验(VOPBA)初筛特异性结合分子。15.应用二维电泳仪进一步分离BHK-21细胞膜蛋白,结合病毒结合试验(VOPBA)获得特异性结合分子；质谱分析该特异蛋白的氨基酸序列。16.采用ZDOCK软件,对潜在靶分子与EDⅢ蛋白分子进行模拟对接,并用KFC2软件对残基进行预测。结果：1.制备的DENV-2EDⅢ多克隆抗体可中和登革病毒。1.1EDⅢ基因片段扩增成功,pET-32a(+)-DV2-EDⅢ的构建；1.2原核表达载体pET-32a(+)-DV2-EDⅢ转化BL21(DE3)感受态细胞；1.3,重组质粒经IPTG诱导后,能在大肠埃希菌中表达E蛋白第三结构域。1.4摸索出重组菌诱导表达的理想条件为：25℃,lmmol/LEPTG,6h;其诱导表达量较高；1.5所获得的重组蛋白纯度可达98.6%,具有良好的免疫反应性；1.6纯化蛋白免疫新西兰家兔,收获抗登革病毒E蛋白第三结构域的多克隆抗体,经酶联免疫吸附试验测定其效价大于1：51200,Westernblot显示重组蛋白具有一定的反应特异性；1.7纯化的EDⅢ蛋白通过在BHK-21细胞上的竞争性分析,重组蛋白能够有效地结合在BHK-21细胞上,同时不同剂量的蛋白阻止病毒进入易感细胞的程度不一样。100ug/ml的纯化蛋白有60%以上的抑制效果。1.8在多克隆抗体的滴度为1：16时,抗体对登革病毒产生90%以上的中和反应,即便抗登革病毒E蛋白的多克隆抗体的滴度为1：1024时,仍存有接近80%的中和能力,结果进一步证实EDⅢ蛋白是潜在的受体连接分子；2VOPBA法筛选到BHK-21细胞上分子量为45kDa的潜在靶分子2.1登革病毒在BHK-21细胞中成功繁殖,纯化病毒的滴度测定为4.52×107PFU/ml:2.2提取的BHK-21细胞膜蛋白经SDS-PAGE蛋白胶分离显示蛋白条带清晰无降解,可以用于下游实验。2.3BHK-21细胞膜蛋白病毒孵育组在45kDa有明显的特异性条带,而阴性对照组无此条带。2.4质谱分析结果匹配分析为胞内骨架蛋白；2.5拟运用生物信息学分析潜在的连接分子与登革病毒之间的相互作用。结论：1.收获的抗登革病毒E蛋白第三结构域多克隆抗体能中和登革病毒,阻止登革病毒进入靶细胞。2.应用VOPBA法在BHK细胞中筛选出与登革病毒连接分子,分子量大小45kDa。3.质谱分析初步鉴定该蛋白为胞内角蛋白,进一步对该蛋白进行研究。4.拟进一步进行生物信息学分析,模拟和预测潜在的靶分子与登革病毒EDⅢ蛋白可能的结合方式和结合位点。综上所述,本研究成功表达DENV2-EDⅢ蛋白,通过免疫家兔获得的多克隆抗体,通过竞争性抑制实验和空斑中和分析实验对所制备的抗体进行评价,认为该多克隆抗体能中和登革病毒,阻止登革病毒侵染靶细胞。采用VOPBA技术筛选到BHK-21细胞膜上分子量为45kDa的登革病毒受体的潜在靶分子,质谱分析显示为细胞角蛋白,可能对登革病毒进入细胞有直接作用。下一步准备利用计算机技术和生物信息学软件对潜在靶分子与DENV-2EDⅢ蛋白可能的结合方式和结合残基进行模拟和预测,丰富和加深对DENV的感染机制的认识,并为后续登革热疫苗的设计以及药物研制提供重要的实验依据。
【作者】杨永红；
【导师】郑学礼；
【作者基本信息】南方医科大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】登革病毒；包膜E蛋白；DⅢ区；BHK-21细胞；生物信息学；VOPBA；受体筛选；

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