马病毒抑制蛋白Viperin抑制马传染性贫血病毒复制的机制

【摘要】宿主抵抗病毒感染的第一道防线就是固有免疫反应。固有免疫反应以干扰素的产生为特征,之后干扰素诱导细胞内大量的干扰素诱导的抗病毒蛋白。虽然一些干扰素诱导的蛋白,如PKR,Mx1,RNaseL,ISG15,APOBEC3G,Tetherin,IFIT等的抗病毒功能已经被阐明,但是干扰素诱导的绝大多数基因的功能尚不清楚。Viperin(Viperin,virusinhibitoryprotein,endoplasmicreticulum-associated,interferon-inducible)是干扰素诱导的内质网相关的具有抗病毒功能的蛋白。近来来,对于Viperin的研究受到了越来越多的关注。研究表明Viperin基因的功能是多种多样的,从抗病毒作用到调节信号通路都发挥重要的作用。Viperin对许多种类病毒的复制都有影响,这些病毒主要包括流感病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、登革热病毒,可以抑制这些病毒的复制。有趣的是,对于人的巨细胞病毒(HCMV),干扰素诱导的内质网相关的抗病毒蛋白可以增加该病毒的感染性。相关研究表明,这种感染性的增加是通过细胞内骨架系统的重建来实现的。Viperin对于慢病毒的作用研究并不是很多,比如人免疫缺陷病毒HIV-1,对其与Viperin的关系尚不是很明确。有些结果甚至有矛盾。比如,一组研究者证实,该基因可以抑制HIV-1的复制,这种抑制是通过抑制病毒的出芽来实现的。另一组研究表明,Viperin只对特定毒株的HIV-1有抑制作用,而对于其他绝大多数的毒株却没有起作用。因此,需要更多的研究来探索Viperin在慢病毒中所起的作用。马传染性贫血病毒(EIAV)是与HIV-1相似的病毒,是反转录病毒科慢病毒属中基因结构最简单的病毒。感染马传染性病毒的马匹通常以反复发热为特征,同时伴有病毒血症,发热,血小板减小症和衰竭症状。EIAV是巨噬细胞嗜性的病毒。感染的巨噬细胞是病毒的储存库,在整个马传染性贫血的发病过程中产生病毒准种以及作为病毒的扩散源。由于马传染性贫血病毒的研究比较广泛,深入研究EIAV与Viperin的相互作用,可为研究Viperin在慢病毒中的作用机制提供更多的资料。为明确马属Viperin对马传染性贫血病毒的作用及其机理,本文克隆了马的Viperin基因,并与人,恒河猴,小鼠以及猪的基因进行了同源性比对。结果发现,Viperin基因的N端70个氨基酸是高变区,包含了疏水的α螺旋,但是其中的几个亮氨酸位点却高度保守,表明这些保守的亮氨酸位点对于疏水的a螺旋区域的功能可能具有重要作用。同时,SAM区域的S1基序(CxxxCxxC)含3个半胱氨酸,在已有报道的几个物种中也是高度保守的。因此,为探明马Viperin与EIAV相互作用的具体机制,以及与其他物种或病毒的区别,本文设计三个步骤进行实验验证：首先,我们想明确EIAV的感染是否会影响到Viperin基因的表达。本文采用定量PCR的方法,发现EIAV病毒感染之后,Viperin的表达在24小时以及96小时出现两个小高峰,在96小时的时候,接毒组是对照组的2.8倍,因此EIAV的感染可以上调Viperin的表达。其次,明确Viperin基因的表达是否会影响EIAV的感染。由于马的巨噬细胞转染效率较低,本实验通过腺病毒载体将Viperin基因导入马巨噬细胞,然后接种病毒,检测EIAV病毒感染后48小时与72小时的病毒产量。结果表明,在72小时的时候,过表达Viperin的巨噬细胞的产毒量与对照组相比下降了将近一半(P<0.05)。同时,我们通过基因敲除(Knockdown)技术对巨噬细胞的Viperin基因进行干扰。结果表明,与对照组相比,下调Viperin基因的表达,可以促进EIAV病毒的产量(P<0.05)。最后,明确Viperin抑制病毒复制的机理。本文将Viperin基因与EIAV的感染性克隆共同转染293T细胞,48小时后检测细胞与上清中EIAV的病毒含量。结果表明,在细胞内的Gag蛋白的表达并没受到影响,但是细胞外的Gag含量随着Viperin的增加而减少,初步表明Viperin抑制了病毒的出芽。为进一步明确这种抑制病毒的出芽是否主要是抑制了EIAVGag的出芽,我们用密码子优化过的Gag质粒与Viperin基因共转染,表明细胞内的Gag蛋白表达没有变化,但是上清中的Gag表达随着Viperin的增多而减少。进一步说明Viperin抑制EIAV的机制之一就是抑制Gag的出芽。为了明确Viperin抑制Gag的出芽是否是通过两种蛋白之间的相互作用完成的,本研究利用激光共聚焦实验进行验证。通过标签抗体的检测,发现两种蛋白可以发生很好的共定位。为进一步确定抑制Gag出芽的关键结构域,本文构建了各个结构域缺失的变异体。结果表明,α-helix和SAM区域对于阻碍Gag的出芽必不可少。但是三种变异体与Gag的共定位并未发生变化。我们推测两者之间的共定位对于阻碍病毒出芽是必要的,但不是关键原因。其中SAM区域对于阻碍病毒出芽更为重要,有研究表明,含有3个半胱氨酸的基序(CxxxCxxC)的变异可以增加丙型肝炎病毒,西尼罗病毒以及登革热病毒的感染性。因此,本文将SAM区域的3个半胱氨酸进行了突变。结果表明,突变其中1个半胱氨酸或者3个半胱氨酸同时突变,依然可以抑制EIAV感染,表明该基序并不是阻碍病毒出芽的关键位点,且与Viperin抑制丙型肝炎病毒感染的机制不同。而人Viperin的SAM区域所含前三个基序S1,S2,S3对于抑制HIV-1的复制是必须的。通过构建相应的变异体,S1的变异并未改变Viperin阻碍Gag出芽的功能。S2的突变可以稍稍减弱其抗病毒功能,S3的变异则彻底破坏了Viperin抑制Gag出芽的功能。S1与S2的联合突变可以破坏Viperin抗Gag出芽的能力。有趣的是,在HIV-1的研究中,S1+S2+S3的突变会影响人Viperin与HIV-1Gag的共定位,而马的ViperinS1+S2+S3变异后,仍然可以保持与EIAV的Gag共定位。Viperin与HIV-1的研究中,只说明了Viperin限制Gag的出芽,对于其他蛋白的影响并没有相关的研究报道。Gag和蛋白(Env)都是HIV-1与EIAV的主要结构蛋白,两种蛋白都与病毒的成熟,出芽有关。Viperin可以抑制Gag的出芽,那么Viperin是否会影响EIAV的Env的出芽呢?EIAVgp140是表面膜蛋白gp90和跨膜蛋白gp45的前体。本文用表达gp140的真核表达质粒与Viperin共同转染293T细胞,结果表明,细胞内Env的表达量随着Viperin的增加而减少。进一步通过构建变异体,我们发现ViperinN末端的α-helix结构域是抑制Env的表达关键,与其他两个结构域无关。因此表明Viperin抑制Env表达的机制与抑制Gag出芽的机制是不同的。另外,EIAV的调节蛋白Tat和Rev是调节EIAV基因表达的非结构蛋白,本文对Viperin是否抑制上述非结构蛋白的表达也进行了研究。通过Tat和Rev的真核表达质粒pEIAV-Tat,pEIAV-Rev与Viperin的表达质粒peViperin分别共转染293T细胞,结果表明Viperin的表达并不能影响非结构蛋白Tat和Rev的表达。因此推断Viperin抑制Env的表达可能是特异性的。为了证明,本文利用半定量PCR的方法,发现Viperin的过表达并不能影响Env的RNA水平。故进一步推测,其作用机制可能是Env蛋白合成后,通过泛素蛋白酶体途径或者溶酶体途径降解了。因此,本文加入了上述两个途径的抑制剂,MG132和氯喹。结果表明,两种抑制剂均对Viperin抑制Env的表达无影响。证明Viperin并不是通过这两种途径抑制Env的表达的。当我们用激光共聚焦观察转染细胞的时候,发现转染Viperin以及变异体(α-helix缺失变异体除外)可以在细胞内看到明显的囊泡状结构。α-helix缺失后则不能看到囊泡的产生。这就表明Viperin可能通过破坏细胞内的囊膜系统而抑制蛋白的表达。我们接着通过电镜观察,进一步证实转染含有α-helix区域的质粒,在细胞内均可以破坏内质网的结构,使内质网变为小泡结构,这些小泡聚集成大的泡状结构。有研究表明,EIAV的受体是ELRl,单独ELR1就可以介导EIAV的进入。前期研究结果表明,Viperin可以通过影响Gag的出芽以及囊膜蛋白Env的表达,Viperin是否会阻碍病毒的进入呢?本文通过慢病毒的方法构建含有ELR1的293T细胞系,通过含有荧光素酶报告基因的EIAV伪病毒来评价Viperin对病毒进入的影响。同时用恒河猴的(rh)TRIM5a作为阳性对照。通过转染HEK293T/ELR1细胞系,24小时之后接种EIAV伪病毒,接种之后24小时裂解细胞检测荧光素酶活性,表明转染Viperin的组可以显著抑制EIAV的进入(P<0.05)。同时,Viperin关键结构域中抑制病毒进入与抑制囊膜表达的结构域相同,都是α-helix结构域起关键作用。由于EIAV的Env与ELR表达都是通过内质网系统表达的,故而Viperin是否通过抑制ELR1的表达来实现抑制病毒的进入?本文将Viperin与ELR1的真核表达质粒共转染293T细胞,转染48小时之后,Western-blot检测结果表明,Viperin的表达可以抑制ELR1的表达,与预期相符。为进一步证实猜测,本文用VSVG包装的含有荧光素酶报告系统的EIAV伪病毒感染细胞,同时做了恒河猴rhTRIM5α的阳性对照。由于VSVG病毒的进入不需要细胞表面受体,发现Viperin阻碍伪病毒进入细胞的能力减弱了(P>0.05)；与此同时,恒河猴rhTRIM5a仍可以显著抑制病毒的进入(P<0.05),进一步验证Viperin是通过抑制ELR1的表达来实现抑制病毒的进入。蛋白质的合成途径主要有两种,细胞质合成途径与内质网合成途径,这两种途径合成方式主要与蛋白的定位有关。EIAV病毒的Gag,Tat,Rev蛋白的合成主要在细胞质中,所以其细胞内的表达未受到影响。但是对于EIAV的囊膜蛋白,EIAV的受体ELR1蛋白而言,它们需要定位在细胞膜上,所以合成途径要经过内质网来合成。在Viperin与流感病毒,HIV-1,HCMV的相互作用中,Viperin可以抑制这些病毒的复制,但并不排除通过下调这些病毒的表面膜蛋白以及在细胞上的相应受体来实现抑制病毒的。例如,HCMV的表面糖蛋白gB就能被下调。疏水的α-helix结构域是抑制病毒囊膜蛋白以及EIAV受体蛋白表达的关键区域,并能引起内质网结构上的变化。但这种变化是如何形成的,是通过调节细胞骨架系统还是别的机制仍有待进一步的深入研究。病毒为了能够存活下来,已经进化出多种多样的机制来对抗宿主编码的限制因子,例如,对于抑制人免疫缺陷病病毒的天然免疫限制因子胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G而言,HIV-1的Vif蛋白可以通过泛素蛋白酶体途径进行将胞嘧啶脱氨酶降解,HIV-2的Vpx也可以通过泛素蛋白酶体途径降解SAMHD1,从而对抗SAMHD1对HIV-2复制的影响。Vpu可以通过改变Tetherin的分布来对抗Tetherin的限制。这使我们想到,EIAV是否也会进化出相应机制来对抗Viperin的限制呢?我们将Viperin与EIAV感染性克隆以及构建感染性克隆的空质粒对照进行共转染293T细胞。通过Western-blot技术检测细胞内蛋白含量。结果表明,在蛋白表达的水平上,EIAV并不能对Viperin的表达有影响,也不能降解Viperin,更不能像其它病毒能够产生一些效应蛋白降解抗病毒分子。咎其原因,可能是EIAV诱导的Viperin表达上调了2.8倍。但这也可能不足以完全的抑制病毒的复制,例如内源性的Viperin也可能不足以诱导内质网的病变。另一种可能就是,EIAV可能通过其他方式来对抗Viperin,而不是将其降解的途径来实现的。综上所述,马的Viperin是抑制马传染性贫血病毒的天然免疫限制因子。本文的研究有助于加深对Viperin抗病毒作用机理的认识,更扩大了Viperin的抗病毒谱范围。本文研究结果表明,Viperin抑制EIAV的复制是全方位的。首先,Viperin具有抑制EIAVGag出芽的功能,主要与α-helix和SAM结构域相关。而且,SAM结构域抑制Gag出芽的关键位点与人Viperin抑制HIV-1Gag出芽的机制不同。其次,Viperin的过表达可以抑制EIAV病毒囊膜基因以及EIAV受体的表达。主要作用机制是通过ViperinN末端疏水的α-helix结构域,破坏内质网的正常结构来抑制囊膜蛋白的表达降低病毒的产量,抑制EIAV受体的表达进而抑制病毒的进入。
【作者】汤艳东；
【导师】黎诚耀；周建华；
【作者基本信息】南方医科大学，免疫学，2014，博士
【关键词】马传染性贫血病毒；Viperin；抗病毒；天然免疫；

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