Myocardin基因在脂肪干细胞向平滑肌细胞分化中的作用及其机制研究

【摘要】[背景和目的]勃起功能障碍(erectiledysfunction,ED)是指阴茎勃起硬度不足以插入阴道或维持时间不足以圆满完成性交。最新研究发现,ED的发病率在不到40岁男性患者为1%-10%、40到49岁为2%-9%、60到69岁为20%-40%,而超过70岁的男人则高达50%-100%。ED是糖尿病(diabetesmellitus,DM)患者常见的并发症,糖尿病是ED最危险的因素,由糖尿病诱发的ED称之为糖尿病性勃起功能障碍(diabetes-inducederectiledysfunction,DIED)。目前DIED的治疗种类虽多,但均有缺陷,如疗程长、疗效不确切、费用高昂、尤其是很大一部分DIED患者对一线药物(5型磷酸二酯酶抑制剂,phosphodiesterasetype5inhibitors,PDE5i)不敏感而又不能或不愿意接受二线(如真空勃起装置)和三线治疗(阴茎假体置入)方案等。因此,探索更理想的方法是DIED临床治疗的迫切需求。阴茎海绵体平滑肌(Corpuscavernosumsmoothmuscle,CCSM),作为阴茎海绵体窦状间隙舒张和阴茎勃起的结构基础,在阴茎勃起过程中对血流动力学改变发挥重要的作用,任何引起CCSM组织或细胞损伤的因素,均可能导致患者ED的发生。有学者提出,糖尿病引起的CCSM细胞数量减少、细胞超微结构发生病理改变及细胞舒缩功能受损是导致ED发生的重要原因。我们也已证实糖尿病性ED大鼠的阴茎海绵体组织及细胞中,平滑肌细胞(SMC,smoothmusclecells)标记物、收缩相关因子a肌动蛋白(SMa-actin,SMA)、平滑肌细胞肌球蛋白重链(smoothmusclemyosinheavychain,SMMHC)、肌滑蛋白(smoothelin)、碱性调宁蛋白(calponin)表达明显下降,CCSM细胞数量减少及细胞舒缩功能受损。因此,DIED的发生与CCSM细胞的病理改变和缺失密切相关,目前尚缺乏从根本上改善这些病理状态的理想方法。随着基因工程技术和干细胞技术的不断发展和应用,给解决这一难题带来了希望。脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)具有自我更新和多向分化潜能,经诱导后在体外可分化为多种细胞,取材方便,由脂肪组织提取后增长速度较快,可自体移植。同时,ADSCs具有诱导多向分化性和表观修饰后能表达特定外源目的基因,其无论在体内还是体外都具有很强的可塑性,用诱导分化后的ADSCs来替代病理改变或缺失的细胞,恢复组织和器官的生理功能,达到治疗疾病的目的,可行性强,应用前景广阔,被认为是未来再生医学中较为理想的种子细胞。Myocardin是一种核受体转录因子蛋白,在SMC分化过程中发挥重要的调控作用,其调控SMC分化的机制主要是通过与血清效应因子(serumresponsefactor,SRF)结合而发挥作用。有学者将Myocardin基因修饰的骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)注入心肌梗死小鼠模型的梗死部位,发现Myocardin基因修饰的BMSCs向平滑肌样细胞分化,同时发现小鼠左室功能明显提高。另外,Madonna等人使小鼠ADSCs高表达myocardinA(Myocardin的一个亚型),结果发现经基因修饰的ADSCs在一定时间内会出现肌细胞样收缩,进一步分析发现这些细胞均表达SMA。大量研究发现,基因修饰干细胞治疗ED较单纯基因治疗和干细胞治疗更具优势。基因修饰干细胞治疗是利用载体将目的基因转移到干细胞内,使干细胞获得新的性状,再通过体内回输而矫正体内异常的基因表达和病变细胞,从而达到治疗疾病的目的。慢病毒载体由于具有携带基因片段容量大,转染效率较高,目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达,以及安全性好等诸多优点,现己成为转移目的基因的理想载体。因此,我们认为若将myocardin基因修饰后的ADSCs移植到阴茎海绵体内,通过增加CCSM细胞的数量及修复其舒缩功能,无疑将会使DIED的治疗达到一个新的高度,但目前国内外还未见有此方面的报道。本研究从体外探讨myocardin基因转染对大鼠ADSCs分化的影响,并对该基因在ADSCs向SMC分化中的作用及其机制进行相关研究,为进一步研究采用myocardin基因修饰ADSCs移植治疗DIED奠定理论基础。[方法]1.大鼠附睾旁ADSCs的体外分离培养及生物学特性研究在SD大鼠麻醉状态下,取其两侧附睾旁脂肪组织,将其洗净、剪碎后,使用胶原酶消化贴壁筛选法进行原代培养,细胞生长融合至80%左右时进行传代培养；对ADSCs进行冻存、复苏实验；MTT检测P3、5、7代及冻存复苏后ADSCs的生长活力,并绘制生长曲线；取P3代和冻存复苏后的ADSCs,分别行多向分化潜能鉴定和表面分子标记CD29和CD44的鉴定。为本课题组利用ADSCs作为种子细胞治疗ED等泌尿男科疾病的研究奠定基础。2.Myocardin基因重组慢病毒载体构建及其在大鼠ADSCs中的表达使用全基因合成技术的方式人工合成大鼠myocardin基因,构建其重组慢病毒载体pLVX-IRES-Neo-myocardin,并对其进行酶切鉴定及测序鉴定；提取重组质粒pLVX-IRES-Neo-myocardin,与包装质粒共同转染293T细胞包装出含有目的基因myocardin的慢病毒颗粒,同时包装出空载体病毒颗粒,分别测定其病毒滴度。将大鼠ADSCs分为实验组(pLVX-IRES-Neo-myocardin+ADSCs),空载对照组(pLVX-IRES-Neo+ADSCs)及空白组(ADSCs),分别用重组慢病毒和空载体病毒感染72h后,采用RT-QPCR和Westernblot检测各组ADSCs中myocardinmRNA和蛋白的表达情况,并进行统计学分析。为应用携带myocardin基因的ADSCs移植治疗糖尿病性ED奠定实验基础。3.Myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用及机制分别将重组慢病毒颗粒pLVX-IRES-Neo-myocardin和空载体病毒颗粒pLVX-IRES-Neo转染大鼠ADSCs,G418筛选2周后,使用免疫荧光(IF)检测转染后细胞中SMA。SMMHC。smoothelin、calponin、myocardin和SRF的表达情况RT-QPCR检测转染后细胞中SMA、SMMHC、smoothelin和calponinmRNA的表达情况,并行统计学分析；Westernblot检测转染后细胞中SMA、SMMHC和myocardin的表达情况,并行统计学分析；Ⅰ型胶原格栅细胞收缩力测定法检测转染后细胞的收缩力；免疫共沉淀(IP)检测转染后细胞中myocardin与SRF之间是否存在相互作用。在体外,从细胞和分子水平探讨myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用,并探讨其部分机制。为接下来从动物和整体水平,观察myocardin基因修饰的ADSCs移植,对糖尿病性ED大鼠阴茎勃起功能的影响及其相关机制的研究提供理论依据。[结果]1.大鼠附睾旁ADSCs的体外分离培养及生物学特性研究体外培养的ADSCs易扩增、增殖迅速,.原代细胞呈短梭形或多角形,传代后以长梭形为主,呈旋涡状或束状排列,形态均一,成纤维样细胞生长。细胞经过多次传代后仍能保持较强的增值能力,其生长曲线呈“S”形。经成脂诱导液培养后,表现出脂肪细胞特性,油红O染色示胞浆内有脂滴出现；经成骨诱导液培养后,表现出成骨特性,茜素红染色出现钙化结节。流式细胞仪检测结果可见ADSCs中CD29和CD44分子阳性率高,CD29阳性率87.2%、CD44阳性率93.5%；ADSCs在液氮中冻存3个月后复苏,其活力仍保持较好,存活率也较高。2.Myocardin基因重组慢病毒载体构建及其在大鼠ADSCs中的表达所获myocardin基因测序证明与GeneBank中序列一致,重组慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Neo-myocardin经酶切及测序鉴定为正确克隆,并包装出病毒,其中重组慢病毒的滴度为2.3×109cfu/ml,空载体对照慢病毒的滴度为4.6×109cfu/ml。重组慢病毒转染大鼠ADSCs后行RT-QPCR和Westernblot检测,结果显示三组细胞均有myocardinmRNA和蛋白的表达,其中,在实验组myocardinmRNA和蛋白的相对表达水平明显高于空载对照组和空白组,实验组与空载对照组和空白组之间存在显著差异(P<0.05),而空载对照组和空白组之间无显著差异(P>0.05)。3.myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用及机制IF检测到经myocardin基因修饰的ADSCs较强表达SMC特异性标志蛋白SMa-actin、SMMHC、smoothelin、calponin及myocardin和SRF,空载对照组的表达则较弱；RT-QPCR结果发现,实验组与空载对照组中均可检测到SMa-actin、SMMHC、smoothelin和calponinmRNA的表达,且在实验组中SMA、SMMHC、smoothelin和calponinmRNA的表达水平明显高于空载对照组,两组之间均存在显著差异(P值分别为0.000、0.001、0.000、0.001)；WesternBlot结果也证实,两组细胞中均可检测到myocardin、SMa-actin和SMMHC蛋白的表达,且在实验组中,myocardin、SMa-actin和SMMHC蛋白表达明显高于空载对照组,两组之间存在显著差异(P值均为0.000)。由此提示,myocardin基因可促进ADSCs向SMC分化。细胞收缩力测定结果得出,在血清及钙离子运载体Calcium-Ionophore作用下,与空载对照组相比,实验组细胞收缩力明显增强(P=0.001)。IP结果发现,实验组和空载对照组均可以检测到myocardin和SRF复合物的形成,但实验组相互作用明显更强。[结论]1.使用胶原酶消化贴壁筛选法从大鼠附睾旁脂肪组织分离培养得到的细胞的确为ADSCs,较纯,生长速度快,且具有间充质干细胞特性,即能黏附到塑料制品上、具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的多向分化潜能,并且能表达特殊的干细胞表面抗原。2.成功构建携带myocardin基因的重组慢病毒载体pLVX-IRES-Neo-myocardin,该载体得以病毒包装,并获得滴度为2.3×109cfu/ml的高感染力病毒。3.成功实现了外源性基因myocardin在SD大鼠ADSCs中的表达。4.在体外,myocardin基因可促进ADSCs向SMC分化。5.经myocardin基因修饰后的ADSCs,其收缩力明显增强。6.Myocardin与SRF的相互作用在myocardin基因诱导大鼠ADSCs向SMC分化过程中起着重要作用。
【作者】张涛；
【导师】韦安阳；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】脂肪干细胞(ADSCs)；myocardin基因；慢病毒载体；平滑肌细胞；分化；

【参考文献】
[1]王婕丽.熔渗法制备纤维结构Mo-Cu复合材料的研究[D].上海工程技术大学,材料加工工程,2014,硕士.
[2]王云兴.锦州港煤炭运输通道研究[D].大连海事大学,交通运输工程,2013,硕士.
[3]徐金凤.基于ANSYS的导向钻井系统非接触电能传输技术研究[D].东北石油大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[4]史晓花.栀子清肝汤加减治疗肝火亢盛型初发甲亢的临床研究[D].北京中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[5]丁一鸣.物联网业务表示与选择机制的研究与实现[D].南京邮电大学,信息网络,2013,硕士.
[6]韩庆文.基于多飞行器测控系统的数字波束形成研究[D].重庆大学,电路与系统,2003,硕士.
[7]罗隽,魏品帅,贺贵明.基于UAP-T的网络日志挖掘技术在电子商务中的应用[J].计算机应用,2003,05:55-57.
[8]唐焱.PRMT2基因的miRNA载体构建及其活性鉴定[D].南华大学,肿瘤学,2012,硕士.
[9]郭梁.浅议碳纳米管在分析化学中的应用[J].化工管理,2014,11:130.
[10]柳晓波.基于供应链视角的地方政府药品监管研究[D].宁波大学,工商管理,2013,硕士.
[11]陈凯,徐贵宝.IT服务管理及其评价标准[J].电信网技术.2008(04)
[12]刘伟.采空区自然发火的多场耦合机理及三维数值模拟研究[D].中国矿业大学（北京）,安全技术及工程,2014,博士.
[13]尹道明.基于云和声搜索算法的知识即服务组合优化研究[D].合肥工业大学,信息管理与信息系统,2013,硕士.
[14]吴敏.研讨班课程和大学生研究计划的设想与建议[J].教育与现代化.1999(03)
[15]牛建军.知识管理与企业信息化[D].辽宁工程技术大学,电气工程,2004,硕士.
[16]王楠楠.九寨沟自然保护区旅游生态系统能值研究[D].南京大学,人文地理学,2013,硕士.
[17]肖永.基于J2EE的精品课程网站设计与实现[D].湖南大学,软件工程,2013,硕士.
[18]寇程.脑机接口结合功能电刺激对脑卒中慢性期大脑可塑性的影响[D].中国人民解放军医学院,康复医学与理疗学,2013,硕士.
[19]胡文迪.非液流型锌溴电池电极修饰及其新型双极板研制探索[D].华东师范大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[20]赵凡.企业竞争情报系统的技术应用研究[D].河北大学,2005.
[21]李然.产品保证网络的信息传播研究[D].杭州电子科技大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[22]程显贺.高薪技术企业知识创新能力评价研究[D].东北石油大学,企业管理,2013,硕士.
[23]庾春梅.城镇化背景下高中德育面临的挑战及对策[D].杭州师范大学,教育管理（专业学位）,2011,硕士.
[24]孙晓敏.77例脑膜癌病患者的回顾性分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[25]孙丽.金及金银核壳纳米棒在玻璃表面的组装及其局域表面等离子体共振传感性能研究[D].苏州大学,分析化学,2014,硕士.
[26]田媚.模拟自顶向下视觉注意机制的感知模型研究[D].北京交通大学,2007.
[27]张硕.难浸金矿细菌氧化—提金废水净化试验研究[D].东北大学,化学工程,2010,硕士.
[28]胡沁涵.高校人才招聘系统的设计与实现[D].苏州大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[29]申家杰.RZ市计量测试所工作质量改进研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[30]曹胜.我国股票市场中小投资者过度交易研究[D].宁波大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[31]刘强.基于改进聚类算法的个别小区无线网络载频配置优化[D].新疆大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[32]郭平,宋宏文,张文坡,舒良树,高艳.辽河油田大民屯凹陷地震资料的成像技术[J].石油地球物理勘探,2006,01:62-66+122+126-127.
[33]张伟.国际工程项目的风险管理研究[D].天津大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[34]黄宁平.网络新媒体环境下的政府形象传播研究[D].江西财经大学,传播学,2013,硕士.
[35]李圆.Periostin蛋白在MCD饲料诱导的非酒精性脂肪肝炎中的功能[D].厦门大学,细胞生物学,2014,硕士.
[36]马东超.浅析山水画中分黑布白要素的表现[D].首都师范大学,美术学,2013,硕士.
[37]薛琨.儿童肥胖与食欲及其影响因素研究[D].复旦大学,营养与食品卫生学,2012,博士.
[38]高雪.《大众日报》在抗日战争中的传播策略研究[D].山东师范大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[39]赵阳.中国实施利率中介目标制的必要性与可行性分析[D].首都经济贸易大学,国民经济学,2013,硕士.
[40]段素萍.银纳米线的制备及其在导电胶中的应用[D].哈尔滨工业大学,2013.
[41]张世恭.正蓝旗旅游业发展过程中的政府职能研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[42]张尧.盛会传媒的硬件基础——从APEC’2001看通信保障在国际会议中的重要作用[J].信息产品与节能.2001(04)
[43]刘雯.资本账户开放对货币危机的影响[D].厦门大学,世界经济,2014,硕士.
[44]杨双.试论需求主导模式校本课程开发[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[45]曹宏伟.青海地区藏族大学生民族认同与国家认同研究[D].青海师范大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[46]张梁.19-20世纪中叶捷克音乐的社会学研究[D].山东艺术学院,音乐学,2012,硕士.
[47]魏永松.江苏省职业社会体育指导员队伍研究[D].中国矿业大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[48]潘腾.全风化花岗岩改良土路基动力响应分析[D].中南林业科技大学,土木工程,2013,硕士.
[49]欧阳春平,曾祥斌,郑一泉,王伟伟,刘勤,李岩,黎静,蔡彤旻.石墨烯制备、改性及其聚合物复合材料研究进展[J].化学工程师,2014,06:42-47.
[50]吴钰骅.软土深基坑工程流变及共同变形性状研究[D].浙江大学,岩土工程,2004,硕士.