乳腺癌全基因组甲基化差异分析与重要功能基因的临床验证

【摘要】总体研究目的和意义：根据国际抗癌协会的资料统计,乳腺癌是女性发病率较高的恶性肿瘤之一,约占23%,全世界每年约120万妇女患病,50万人死亡,发病率和死亡率居妇女各类恶性肿瘤之首,并以每年0.3%-8%的速度增长。在中国妇女乳腺癌的发病率呈上升趋势,成为危害女性健康的主要杀手,占女性恶性肿瘤的32%。据全国肿瘤登记中心收到的共计49个肿瘤登记地区上报的2006年恶性肿瘤登记资料显示,乳腺癌作为中国女性发病率第一位的恶性肿瘤,其发病率为23.3/10万,死亡率也已上升到4.71/10万。目前国际认可的最常用的乳腺癌风险预测方法是Gail模型,然而其对散在乳腺癌预测精确度只有大约58-59%,而且对亚洲人的适用性仍未知。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变与家族性乳腺癌密切相关,但只占5-10%的乳腺癌。近期的全基因组关联研究(GWASs)已经确定了基因多态性与乳腺癌风险相关,一组10个SNPs有59.7%的预测精确度。因此,已知乳腺癌的环境和遗传危险因素在预测一个妇女患病风险上是有限的。早期诊断和早期治疗是提高乳腺癌患者生存率与生活质量的关键；然而目前用于乳腺癌早期诊断的手段主要是自我检查和影像学检查,这些手段有约30%的漏诊率。而且即便是Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌仍有15%-25%最终会发生远处转移。因此,进一步明确乳腺癌发生发展的分子机制、寻找新的治疗靶点以及探索科学的综合治疗模式以提高早诊早治率,是乳腺癌研究的重要内容。多年来人们一直在探索通过外周血检测肿瘤的最佳标志物,并试图通过这一便捷、易被医患双方所接收的方式达到肿瘤预警、早期诊断、监控病情、判断预后的目的,然而迄今尚无理想的结果。恶性肿瘤的发生是环境与遗传因素作用下多阶段、多步骤、多基因异常累积的结果,其中最主要的环节是癌基因的激活和抑癌基因的失活。根据经典肿瘤发生的“二次打击理论”,认为抑癌基因的失活有两条途径,即基因内突变和染色质丢失。然而随着研究的深入,人们发现某些恶性肿瘤DNA序列完整,并未有突变、缺失,“二次打击理论”无法解释抑癌基因何以失活。这种用传统遗传学无法解析的现象,催生了与遗传学相对应的另一门新兴学科-一表观遗传学。DNA甲基化是一种重要的遗传外修饰,是表观遗传学的重要组成部分,是调节基因组功能的重要手段。DNA甲基化主要发生在G/C含量丰富的CpG二核苷酸位点(CpG岛),CpG岛对基因的表达起着调控作用,具有特殊的意义。在人类和多数哺乳动物,DNA甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶。正常细胞DNA序列CpG位点约有70-80%发生了甲基化,而大多数CpG岛内CpG位点完全无甲基化。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用。近期研究直接分析了基因启动子的CpG岛甲基化,并与LOH或突变分析相结合,证实基因启动子高甲基化是抑癌基因失活的第三种机制,并且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一机制,并参与多种肿瘤的发生、发展过程。如Yan等利用外显子测序和甲基化芯片分析发现在急性单核细胞白血病中DNMT3A高突变率,且具有该突变的同时伴随有该基因DNA异常甲基化的出现,进一步验证了启动子甲基化在肿瘤研究中的重要地位。因此,大量关于启动子异常甲基化与乳腺癌相关性的研究随之开展。许多证据表明,DNA过甲基化是乳腺癌发生发展过程中的常见现象,且往往意味着乳腺癌关键基因表达的缺失,主要包括细胞周期控制基因、肿瘤易感性基因、肿瘤代谢酶基因和细胞粘附分子基因等。vanHoesel等认为启动子甲基化是乳腺癌发生的早期事件,具有细胞与组织异质性,甲基化表型可早于肿瘤恶变的出现,MINT17,MINT31,RARbeta2,RASSF1A基因甲基化可用于早期诊断及预测肿瘤的恶性程度。Xu等发现BRCA1基因甲基化的三阴乳腺癌患者预后好,且可用于预测此类患者的化疗敏感性。Aran和Hellman分析了转录增强子DNA甲基化与乳腺癌易感性的相关性。基因启动子异常甲基化不仅是多种癌症发生发展过程中重要的表观遗传改变,而且在标本量不大的情况下,比起蛋白质和RNA,DNA甲基化更适合作为早期诊断的敏感生物学指标。由于DNA甲基化在不同肿瘤组织中的高度特异性,检测癌症患者体液中基因异常甲基化越来越受关注。Xu等收集298例乳腺癌患者和612例健康女性外周血标本,检测其甲基化情况,随访5年后发现外周血基因甲基化预测患乳腺癌风险的精确度较Gail模型(65.8%vs.56.0%)和GWASs(65.8%vs.58.8%)均高,认为外周血基因甲基化谱有望成为预测乳腺癌风险的有效指标。目前虽然在乳腺癌的异常甲基化相关基因研究方面取得了一些进展,但大部分研究只是针对几个或一群基因作为候选基因研究方法。迄今,尚无学者对乳腺癌的异常甲基化在全基因组层面上进行直接、全面系统分析。乳腺癌甲基化谱的建立不仅有助于全面揭示乳腺癌发生的分子机制,更重要的是可为乳腺肿瘤的诊断、治疗、病情监控及预后等提供非常有价值的线索及可靠的科学依据。本研究采用最新发展的全基因组高密度甲基化芯片技术,对乳腺癌组织和正常乳腺组织中异常甲基化的基因进行了初步筛选检测。通过本研究筛选出乳腺癌异常甲基化的基因,初步为乳腺癌甲基化谱的建立奠定了基础,同时也为寻找乳腺癌的诊断、治疗和预后等分子标志物提供可能的线索,而且进一步寻找乳腺癌发生发展的分子机制并有针对性的加以功能验证是我们关注的重点。以下将分成三个方面进行详细介绍。第一部分InfiniumHumanMethylation450芯片的乳腺癌甲基化差异性分析目的：应用高密度基因芯片(450KInfiniumMethylationBeadChip)技术分析人类乳腺癌病变组织与正常乳腺组织全基因组的DNA甲基化基因差异水平。材料与方法：收集6份乳腺癌标本和6份正常乳腺组织标本,提取组织DNA,行重亚硫酸盐转化,与IlluminaHD450KInfiniumMethylationBeadChip芯片杂交,检测450,000多个甲基化位点,全面覆盖了96%的CpG岛,通过cluster聚类分析和显著性检验分析乳腺癌病变组织与正常乳腺组织中的DNA甲基化水平差异情况,对DeltaData进行筛选统计。结果：乳腺癌病变组织与正常乳腺组织间共发现3268个基因存在DNA甲基化水平差异(DiffScore值50,P<0.00001),甲基化程度升高基因1926个,甲基化程度降低基因1342个。两组全部差异基因的平均甲基化水平实验组较正常对照组高。异常甲基化基因在染色体分布比较均匀,位于1号染色体的基因占14%,位于3号染色体基因占8%。对获得的差异基因进行聚类分析,结果提示：乳腺癌DNA甲基化差异主要集中在细胞粘附分子、细胞信号通路及其能量传导、细胞周期、细胞凋亡相关、细胞周期蛋白类相关基因。这些基因的DNA甲基化改变可能是导致乳腺癌发生发展的原因之一。结论：应用全基因组高密度甲基化芯片对人类乳腺癌病变组织与正常乳腺组织进行的系统研究表明：乳腺癌患者与正常妇女间的基因存在不同的甲基化类型,这些DNA甲基化差异的发现,为进一步研究乳腺癌发生发展的分子机理及其防治新方法的研究奠定了基础。因此,根据显著性检验分析结果,对存在甲基化显著性差异的基因进行进一步的验证,了解这些基因在乳腺癌发生发展过程中的作用。第二部分RARβ基因甲基化可用于判断淋巴结转移乳腺癌患者的预后目的：视黄醇受体(Retinoicacidreceptor,RAR)基因作用于恶性肿瘤细胞系的反转录过程,抑制肿瘤细胞的增值。RAR与乳腺癌有着非常密切的关系,其中RARβ基因作为乳腺癌抑制因子受到广泛的关注,如果失去了RARβ基因的调节作用就会诱发恶性肿瘤的发生。RARβ基因坐落于3p24上,该区域存在着乳腺癌杂合性丢失的高概率(45%)。但是,LOH不能作为一个独立的因素抑制RARβ基因的表达,因此通过其进一步的研究证明,RARβ基因启动子5’端区域的甲基化与乳腺癌发生具有着重大的关系。本研究的目的是探讨RARβ基因的DNA甲基化在乳腺癌发生发展过程中的意义,为阐明其在乳腺癌的分子机制奠定基础。材料与方法：收集原发性浸润性乳腺癌及其相应的癌旁组织192例,提取组织DNA,行重亚硫酸盐转化,设计了两对特异性扩增引物,应用甲基化特异性PCR(methylationspecific-PCR,MSP)法,检测乳腺癌和正常乳腺组织中RARβ基因的DNA甲基化状态,并结合其临床病理特性和预后进行统计学分析。结果：192例乳腺癌组织中RARβ基因甲基化者50例(26%),而在正常乳腺组织中无一例甲基化,差异有统计学意义(P<0.05)。直径>20mm、Ⅲ期乳腺癌及浸润性非导管型乳腺癌与直径<20mm、Ⅰ/Ⅱ期及导管型乳腺癌相比RARβ基因甲基化率具有显著性差异(P<0.05)。淋巴结转移、ER阴性、PR阴性及erbB2过度表达的癌组织中RARβ基因甲基化率增高,但无统计学意义。RARβ基因甲基化率与患者年龄、倍数性及TP53突变无显著相关性(P>0.05)。再对卡方检验中有意义的变量使用logistic回归分析,结果示乳腺癌分期与组织学分型对RARβ基因甲基化与否的影响具有统计学意义。RARβ基因甲基化的肿瘤ER平均值(Mean±SD值)为119±151fmol/μg、PR平均值(Mean±SD值)为91±154fmol/μg,均低于无RARβ基因甲基化肿瘤ER平均值137±169fmol/μg、PR平均值(Mean±SD值)为132±205fmol/μg,但均未达统计学意义。生存曲线分析显示RARβ基因甲基化的乳腺癌患者平均生存65.53(59.21-71.85)月,低于无RARβ基因甲基化患者的69.06(65.84～72.28)月,然而经Log-rank检验,两组生存率曲线的差别无统计学意义(χ2=1.23,P=0.268)。在淋巴结转移的乳腺癌患者中,RARβ基因甲基化的患者平均生存52.43(40.56～64.30)月,显著低于RARβ基因无甲基化的患者的73.13(65.12～81.14)月,经Log-rank检验,两组生存率曲线的差别有统计学意义(χ2=4.230,P=0.040)。结论：RARβ基因甲基化在乳腺癌的发生、发展中起着重要作用,可能与乳腺癌的侵袭性密切相关,可作为判断淋巴结转移的乳腺癌预后的分子生物学指标。第三部分乳腺癌患者PTPRO基因异常甲基化的预后价值及其外周血检测的临床意义目的：编码膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(Proteintyrosinephosphatasereceptor-typeO,PTPRO)基因是蛋白酪氨酸磷酸酶PTPs家族成员之一,是细胞增殖、分化、代谢、细胞与细胞间通讯、基因转录以及细胞存活等重要信号通路的媒介,参与细胞生长、分化、分裂周期、癌基因转化等多种过程,是新近发现的一个潜在抑癌基因,其在癌症发生机制中的作用是目前研究的热点。另外,检测肿瘤患者外周血中肿瘤相关标志物亦是当前肿瘤研究的热点之一,恶性肿瘤患者外周血中存在游离的肿瘤相关DNA已引起肿瘤学界的极大关注,人们曾在多种肿瘤患者外周血中发现V原发肿瘤相同的DNA变异。本研究以PTPRO基因启动子甲基化作为潜在肿瘤标志物,探讨乳腺癌患者外周血中游离的肿瘤相关DNA及肿瘤组织与临床病理参数包括预后的相关性。材料与方法：采用甲基化特异性PCR法及半定量反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)法,检测乳腺癌组织、癌旁正常腺体组织、乳腺癌细胞株及外周血中游离DNA中PTPRO基因启动子甲基化状况及其表达水平,并结合其临床病理特性进行分析。乳腺癌细胞株培养及去甲基化实验,验证PTPRO基因启动子甲基化与表达水平的相关性。结果：98例乳腺癌组织中PTPRO基因启动子的甲基化率为55%(54/98),与其相应外周血DNA中PTPRO基因启动子的甲基化率为34%(33/98),而对照组正常乳腺组织中无1例有PTPRO基因启动子的甲基化。肿瘤组织未检测到甲基化的患者及健康人血浆中均未检测到该基因甲基化变异。外周血中PTPRO基因启动子的甲基化与肿瘤组织的该基因的甲基化状况显著相关(c=0.435,P=0.000)。发病年龄≥46岁的乳腺癌患者与年龄<46岁的患者PTPRO基因甲基化率有显著性差异(χ2=4.178,P=0.041)。分期晚(χ2=8.616,P=0.003)、低分化级别(χ2=5.139,P=0.023)、淋巴结阳性转移(χ2=6.273,P=0.012)及HER2过度表达(χ2=12.124,P=0.0005)的乳腺癌与分期早、中-高分化、淋巴结无转移及HER2阴性的患者相比肿瘤组织中PTPRO基因甲基化率具有显著性差异。再对卡方检验中有意义的变量使用logistic回归分析,结果示乳腺癌分期与HER2过度表达对PTPRO基因甲基化与否的影响具有统计学意义。ER阴性及PR阴性的癌组织中PTPRO基因甲基化率增高,但未达统计学意义。PTPRO基因甲基化率与患者肿瘤大小、组织学分型及p53肿瘤蛋白(tumorprotein53,TP53)突变无显著相关性(P>0.05)。而乳腺癌患者外周血中PTPRO基因甲基化率在HER2过度表达者显著增高(χ2=4.899,P=0.027),与其他临床病理学特征无显著相关性。单变量分析显示PTPRO基因甲基化的乳腺癌患者预后差,且具有统计学意义(χ2=17.240,p=0.000)。在ER+组、PR+组和HER2+组,亦有类似的结果(分别为χ2=12.844,p=0.000:χ2=7.195,p=0.007和χ2=8.603,p=0.003).经多变量分析显示PTPRO基因甲基化可作为乳腺癌患者一个独立的预测预后的分子生物学指标(χ2=5.506；p=0.019)。另外,对PTPRO基因甲基化且表达抑制的乳腺癌细胞株用5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)进行去甲基化实验,发现PTPRO基因再表达。因此,这些数据显示PTPRO甲基化导致基因失表达。结论：PTPRO基因启动子甲基化在乳腺癌的发生、发展中起着重要作用,与乳腺癌的预后相关,可作为一个独立的预后生物学指标,本研究亦首次报道了PTPRO基因甲基化作为乳腺癌临床诊断的新颖的无创性分子生物学指标的可能性。总结：本研究采用最新发展的全基因组高密度甲基化芯片技术,全面覆盖了96%的CpG岛,450,000多个甲基化位点,检测乳腺癌组织和正常乳腺组织,通过cluster聚类分析和显著性检验分析乳腺癌差异表达基因的甲基化差异情况,对异常甲基化的基因进行了初步筛选,结合其在乳腺癌发展过程中的分子生物学功能研究,抽选了其中两个显著性差异(p值最小)的基因进行临床验证,得出如下主要结论：1.RARβ基因(p=1.44E-07)甲基化可作为判断淋巴结转移的乳腺癌患者预后的分子生物学指标；2.PTPRO基因(p=2.405E-06)可作为乳腺癌的一个独立的预后生物学指标,以及作为乳腺癌临床诊断的新颖的无创性分子生物学指标的可能。因此,通过本实验为乳腺癌甲基化谱的建立初步奠定了基础,如果继续扩大研究,有望开发出乳腺癌筛查血清学标志物试剂盒,并应用于临床：肿瘤预警、早期诊断、监控病情、判断预后等。
【作者】李少英；
【导师】罗荣城；
【作者基本信息】南方医科大学，肿瘤学（专业学位），2014，博士
【关键词】乳腺癌；DNA甲基化；基因芯片；表观遗传；视黄醇受体β(RARβ)；甲基化；预后；编码膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)；生物学指标；

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