新型表面化学SPR蛋白芯片的构建及其在CITP免疫紊乱诊断中的应用

【摘要】研究背景表面等离子体共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)是当今应用最普遍的非标记光学生物传感器(Label-FreeOpticalBiosensor)技术,正在被越来越普遍地用于生命科学等多个领域。SPR技术不需要对被测物进行标记的优点使其可以测量生物活性分子在无修饰条件下的反应动力学,适用于高通量生物活性分子特别是小分子的筛选,微量未知物的分析,以及在线样品检测。但其核心技术为光路检测系统、微流控进样系统和SPR芯片。目前改进基质材料的表面处理技术,建立高效和快速的芯片活化方法,并能保持芯片表面物质的稳定性和生物活性是该领域研究的热点,同时与微流控技术相结合可降低样品消耗量,提高检测通量。因此,优化SPR芯片表面的功能,探索建立高通量、简便快速、灵敏度高、特异性强的SPR技术应用于临床检验诊断具有重要的意义。慢性特发性血小板减少性紫癜(Chronicidiopathicthrombocytopenicpurpura,CITP)是一种常见的出血性自身免疫病,在我国的发病率呈上升趋势,严重影响患者的生活质量,但因发病机制不明,还难以找到真正特异且有效的治疗方法。近年免疫调节治疗方式引起了人们的兴趣,可能从源头上改变相关的治疗效果。最近研究表明新型调节性B细胞(Breg)具有负性调节作用,在免疫学领域越来越受重视并被积极研究,我们前期预实验发现Breg细胞可能在CITP患者免疫紊乱中发挥重要作用,CITP患者体内Breg的变化可能与CD4+Th细胞亚群和血小板抗体之间有重要关系,因此需要对该问题进行深入研究,并探索一种简便、快速的检测方法,为CITP的临床诊断与治疗寻找新的靶点与思路。血小板抗体的检测是国内外研究的热点,虽然方法有多种,但因价格太高,或操作复杂,或易至假阳性或假阴性等问题,临床应用较少；CD4+T等相关细胞因子紊乱的检测方法主要为ELISA、流式细胞术和PCR等,都难以高通量快速检测多种因子,限制了它们的临床应用。因此,利用SPR技术优势,探索SPR芯片技术应用于CITP患者的免疫紊乱的动态联合检测,对临床诊断、治疗策略选择、临床效果评价和预后分析以及血小板相容性输注治疗等方面具有非常重要的意义。研究目的构建与优化新型表面化学SPR蛋白芯片,建立基于SPR技术高通量、简便快速、灵敏度高、特异性好的新型免疫学检测方法：针对CITP治疗效果差,发病机制复杂以及新型调节性B细胞在自身免疫性疾病中的作用特点,本研究拟分析CITP患者外周血新型调节性B细胞的变化特征、及其对患者血小板抗体与CD4+Th细胞紊乱的调节作用；探索新型SPR芯片技术在CITP免疫紊乱诊断与疗效评价中的应用价值,为CITP免疫紊乱的检测寻找新靶点与新方法,同时也为新型SPR芯片技术应用于其它相关免疫病的临床检验诊断提供参考。研究内容1、构建灵敏度高、特异性好的新型表面化学SPR蛋白芯片,进行相关性能的综合评价,并对两种SPR芯片比较分析。2、研究CITP患者外周血新型调节性B细胞的变化及其与血小板抗体的相关性,并分析它们在CITP患者免疫紊乱中的作用。3、运用新型表面化学蛋白芯片,建立高通量、非标记的SPR技术筛检CITP患者血小板抗体的新方法,并与固相凝集法和MAIPA法对比分析。4、研究CITP患者外周血新型调节性B细胞的变化与CD4+T细胞的相关性,分析相关的细胞因子在CITP免疫紊乱中的作用。5、运用新型表面化学蛋白芯片,探索建立高通量、非标记的SPR技术动态、特异性联合检测CITP患者Breg与CD4+T细胞相关因子紊乱的新方法。研究方法1、SPR芯片Poly(OEGMA-co-HEMA)表面的制备利用二元自组装体系对引发剂表面浓度进行控制,以乙醇为溶剂,配制硫醇引发剂和PEG硫醇混合溶液。将经过UV-ZONE处理的芯片浸泡在上述混合溶液中,放置15小时。取出芯片,用乙醇充分淋洗,氮气吹干。称取2,2’吡啶12.5mg、OEGMA5262.62g和HEMA0.65g,加入溶剂超纯水5ml和甲醇5m1搅拌溶解。加入1mLCuCl2的溶液(0.04mM),通入氮气,排除氧气15min。随后利用注射器缓慢注入1mL抗坏血酸溶液(0.04mM),Cu(II)配合物逐渐被还原为Cu(I)的配合物,反应溶液由通常的淡蓝色变为淡红色。继续无氧处理15min。表面引发聚合反应在氮气环境的手套箱中进行。将有引发剂的芯片,浸泡在反应溶液中。芯片表面将引发单体在聚合于芯片表面,在室温下反应8小时后,将芯片取出,终止反应,并用甲醇和超纯水清洗干净,氮气吹干。基质Poly(OEGMA-co-HEMA)侧链末端羟基活性较差,很难在温和条件中与蛋白质进行偶联反应,所以必须对羟基进行功能化：将表面修饰poly(OEGMA-co-HEMA)的芯片浸泡在含有丁二酸酐(10mg/mL)和DMAP(15mg/mL)的DMF反应溶液中,温室下反应12小时。将芯片取出,用DMF和乙醇充分淋洗,氮气吹干。2、SPR芯片动态环糊精表面的制备利用自组装单层技术在芯片表面组装PEG单层作为主链,其中利用稀释剂控制主链PEG的链密度；将芯片浸泡于环糊精溶液中,当足量的环糊精穿入PEG主链后,对线性PEG另一端进行封端。再通过羟基化反应将环糊精的羟基基团转为羧基等活性基团,便于固定生物探针分子。利用SPR技术系统实验参数(链密度、链长度、羧基数量)对于其在生物检测性能的影响,优化出最佳的制备条件。在优化的实验条件下制备基于环糊精分子的传感器基质,并应用该基质检测模型蛋白。3、新型化学表面SPR芯片的表征方法(1)AFM表征：基质在干态下的形貌结构由原子力显微镜(AFM,Veeco,Dimension3100)表征,实验采用接触式模型；(2)椭圆偏振表征：膜厚由M-2000V型分光椭圆偏振测量仪测量,测量角度为65、70和75度,测量波长为400nm到800nm。椭圆偏振仪数据用特定的模型拟合得到膜的厚度,其中SAMs和Poly(OEGMA)采用Cauchy模型,(An,Bn)分别为(1.45,0.01)和(1.46,0.01)。样品厚度值为三个位置测量值的平均,报道结果为平均值±标准差。4、新型化学表面SPR芯片性能评价(1)抗污效果测试：按照仪器操作手册将芯片(羧基功能化芯片)装载后,设定工作温度25度,流速2μL/s,通入PBS缓冲溶液(pH=7.4),得到稳定基线后注入特定浓度的蛋白质溶液(PBS缓冲液稀释),最后通入PBS缓冲溶液。(2)蛋白检测能力测试：按照仪器的操作要求设定点样矩阵参数,将30uL点样样品添加384孔板中。设定温度为25度,湿度为50%。用接触方式将蛋白样品点样于SPR芯片表面。点样后芯片放置于25度,湿度为75%的恒温恒湿箱中2小时；将蛋白质芯片安装于SPR系统中,通入PBS缓冲溶液(pH=7.4),流速2μL/s,得到稳定基线后,通入封闭试剂乙醇胺(10mmol/L,pH=8.5)7min,封闭多余的活性位点。注入特定浓度的蛋白质溶液(PBS缓冲液稀释),利用甘氨酸溶液(10mM,pH=2.0)可以洗掉结合的蛋白,从而达到再生的目的。5、标本采集及细胞分离培养分别采集激素治疗前后的CITP患者和正常对照组静脉血各5mL,肝素钠抗凝,密度梯度离心法分离PBMC,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整PBMC密度为1×109/L。其中1mL细胞悬液,用于荧光抗体染色,FCM测定Th1、Th17、Th22以及Breg细胞亚群；另取1mL细胞悬液加佛波酯PMA(终浓度为50μg/L)、离子霉素(终浓度为1μmol/L)置37℃温箱中培养过夜,收集上清置-70℃冻存待ELISA及SPR芯片技术检测细胞因子。6、FCM法检测Th1、Th17、Th22及Breg细胞亚群取5支试管,分别取上述淋巴细胞分层液分离单个核细胞,PBS洗2次计数,各取106个单个核细胞,其中第1支试管作为同型对照；第2支试管加入FITC-CD4抗体、PE-IFN-y抗体各5μL；第3支试管加入FITC-CD4抗体、PE-IL-17A抗体各5gL；第4支试管加入FITC-CD4抗体、PE-IL-22抗体各5μL；第5支试管分别加入CD5-FITC、CD1d-PE、PerCP-CD19抗体各5ul,同时设立同型对照,加入IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP抗体各10μL,然后将标本与抗体充分混匀后,加入破膜剂,室温避光孵育1h。取出后用2ml红细胞裂解液裂解10min,离心后弃上清,用PBS洗2遍,上流式细胞仪检测,相关检测结果运用软件分析比较。7、ELISA法检测PBMC培养液上清相关细胞因子的水平取上述各组按要求冻存的PBMC培养上清,用ELISA法检测各组IL-10、TGF-p1、IFN-γ、IL-17,IL-22水平,按试剂盒说明书操作,每个样本和标准品均设3个复孔,酶联仪测定450nm波长吸光度(A450),各标准品均绘制相应的标准曲线,根据检测的吸光度值在各个标准曲线上确定对应的细胞因子浓度。8、新型化学表面SPR芯片检测条件的摸索影响SPR芯片表面固定的因素：主要是离子强度,溶液的pH值及蛋白抗原的浓度等。本研究是在一定的离子强度下,将血小板抗原进行倍比稀释后,分别点样芯片,根据不浪费样品,又能保证达到一定的固定量的原则,确定血小板抗原的稀释度。同时我们选用了不同pH值(分别为4.0,4.5,5.0,5.5,6.0)的10mmol/L醋酸盐缓冲溶液作为血小板的固定液,探索pH值对血小板抗原固定的影响,确定最佳pH值。芯片的表面再生原理是利用一定浓度的酸、碱、或者是高离子强度的溶液脉冲来洗脱抗原与抗体间的结合,从而达到传感芯片的再生。关于采用再生试剂中我们尝试采用了10mMNaOH,1:300稀释的磷酸、pH=2.0的甘氨酸作为再生试剂,确定最佳的再生试剂类型。9、血小板在SPR芯片表面固定的方法(1)SPR芯片活化：先室温下分别溶解0.3939克EDC(0.4M)和0.430克NHS(0.1M),配制成10mLEDC/NHS活化液,将SPR芯片置于活化液中活化30min,流水冲洗；(2)血小板抗原点样：用pH值为6.0的10mM乙酸盐与甘油配制10%的甘油点样液,将通用型血小板抗原用点样液作5倍稀释处理后,取0.5μL混合液点样于芯片表面相应的位置,室温下固定1小时；(3)芯片表面封闭：将点样好的SPR芯片,固定后,安装在SPR分析仪上,用PBS液调选最佳共振角(由最小角至最大角调试,再确定最佳的共振角约为70至100之间),基线平稳后,用封闭液乙醇胺处理10min,封闭芯片未反应的活化表面。完成后用再生液处理,去除物理吸附的物质和封闭液,然后可上样检测。10、SPR芯片技术检测血小板抗体的性能比较SPR技术性能分析：运用上述探索的条件及固定的SPR芯片,将阳性对照血清、阴性对照血清、患者样本等作相应的检测,分析SPR技术的稳定性、敏感度、特异性,SPR分析仪检测的数据运用BIAevaluation软件分析；(2)对比研究：运用SPR技术、固相疑集法及MAIPA法同时对40例CITP患者进行血小板抗体筛选,比较三种方法的差异性,并分析它们的性能。11、SPR芯片技术检测血小板抗体及临床应用对CITP患者采用SPR技术作配合性试验,选择配合型血小板输注,并跟综分析临床疗效。具体检测方法：将已知的O型通用血小板(抗原)固定在芯片上(芯片准备的方法按上述进行),检测患者血清中是否有相关抗体；同样将供者的血小板洗涤后稀释,取微量(0.5μL)点样于芯片上,检测血小板抗体阳性患者的血清是否存在SPR信号的改变,若无信号改变,说明它们是配型相合,否则为配型不相合。运用该技术对10例血小板抗体阳性患者选择配合的血小板进行输注,并进行临床跟综分析,研究患者临床血小板输注的有效性。12、SPR芯片技术检测CITP患者PBMC培养液上清细胞因子的水平取上述冻存PBMC培养上清,采用SPR芯片技术检测上清中IFN-y、IL-17、IL-22、IL-10水平,具体操作是取出前述研制好的SPR新型芯片,活化处理后,分别将抗-IFN-γ、抗-IL-17A、抗-IL-22、抗-IL-10的抗体点样于芯上,固定60分钟后上机检测,同时点样PBS作为空白对照(由于该芯片的性能分析已在前面研究了,在此不再重复叙述)；上述细胞因子的标准品配制成不同的浓度,上机检测的信号响应值(RU)绘出它们相应的标准曲线,根据标准曲线可计算出相应的细胞因子的含量。13、建立CITP特异性细胞因子-SPR芯片检测平台该研究探索性研究,为CITP患者细胞因子的特异性检测进行摸索：先将CD4抗体固定在芯片上,捕获CD4+T细胞,芯片上刺激培养细胞,然后在芯片上动态检测细胞因子的变化,并与正常对照组比较分析,该方法的建立将有助于CITP患者的细胞免疫紊乱更准确特异的分析。我们将以检测CD4+T细胞分泌IFN-γ为例进行方法学研究。14、统计学分析方法各组实验结果均用x±s表示,采用SPSS16.0软件分析,完全随机设计的两本均数比较,采用两样本t检验；多样本均数间两两比较采用方差分析(ANOVA);两变量的相关程度用Spearman相关分析法；以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、基于初步掌握SIP动力学基础上,我们充分利用表面引发聚合反应技术活性可控的优点,在纳米尺度上调控分子基质poly的相关参数(链密度、厚度),搭建了一个基于高分子poly(OEGMA-co-HEMA)的生物传感器基质平台,实现“零”蛋白非特异性吸附和较高蛋白固定能力的高度统一,解决了生物传感器的共性问题。2、利用自组装单层技术在芯片表面组装PEG单层作为主链,其中利用稀释剂控制主链PEG的链密度；将芯片浸泡于环糊精溶液中,当足量的环糊精穿人PEG主链后,对线性PEG另一端进行封端；通过羧基化反应将环糊精的羟基基团转为羧基等活性基团,便于固定生物探针分子,成功构建了新型的SPR芯片环糊精表面。3、实验结果表明,本项目研发的芯片具有很好的抗蛋白质非特异性吸附能力；但是,随着羧基化的程度的增加,基质的抗蛋白非特异性能力有所下降,主要由于羧基修饰后芯片表面带电荷所致。静电吸附一方面使得芯片出现非特异性吸附,但从另一个角度看来,静电吸附在固定蛋白(特别浓度比较低的蛋白溶液)起重要作用：有利于蛋白质在芯片表面富集,提高蛋白质的固定效率。4、本项目采用模型蛋白人IgG/山羊抗人IgG系统验证两种芯片检测蛋白质相互作用的应用效果。实验结果表明：两种芯片均较高的固定蛋白质的能力,而且能够保持蛋白质生物活性,但动态的环糊精表面比poly(OEGMA-co-HEMA)基质的灵敏度更高,相同浓度的蛋白信号响应值更大。5、FCM检测结果显示,与对照组比较,CITP患者外周血中CD19+B、CD5+CD19+B细胞亚群的比例均升高,差异有统计学意义(P<0.05)；而Breg的比例降低,差异有统计学意义(P<0.05)。6、ELISA法测定结果显示,与健康人对照组比较,CITP患者PBMC培养液相关细胞因子IL-10、TGF-β1的表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05);CITP患者外周血中Breg的比例与PBMC培养液上清中IL-10的水平呈正相关(P<0.05),与TGF-β1水平无相关性(P>0.05)；调节性B细胞的变化与患者血小板抗体的水平呈负相关性(P<0.05)。7、采用乙酸缓冲溶液稀释血小板,分别稀释5倍,10倍,20倍,50倍,100倍。结果表明随着点样的浓度增加检测分析物(含血小板抗体血清)信号值增加,稀释到10倍后,点样物的浓度对检测信号影响不明显；分别采用系列pH值(pH=4.0,4.5,5.0,5.5,6.0)的乙酸缓冲溶液作为点样液稀释血小板。通入分析物(含血小板抗体血清)结果表明在pH=4.5的乙酸缓冲溶液时具有较强的检测信号。在NaOH的缓冲溶液中,高分子链部分水解,导致基线往下漂移,而采用1：300稀释的磷酸基线没有回到原始基线水平即再生彻底。在采用pH=2.0的甘氨酸再生后基线基本回到初始值水平,而且再生后探针仍然保持较高的生物活性。8、在同一张芯片上点样试剂血小板抗原与非特异性NS1抗原,其中点样一个为空白对照点,其余各点为样本检测点,将此点样好的芯片在SPR仪上分别检测血小板抗体阳性对照血清与NS1抗体阳性对照血清,结果表明SPR芯片能特异检测血小板抗体。对40例CITP患者,分别用SPR芯片技术、固相凝集法和MAIPA法检测,经McNemr检验,SPR芯片技术与固相凝集法比较(P>0.05),一致性为92.5%。SPR芯片技术与MAIPA法比较(P>0.05),SPR法的灵敏度为96.3%,特异性为92.3%,总一致性为95%,三种方法差异均无统计学意义。9、将ABO同型的供者血小板样本,经洗涤后稀释,按照上述血小板点样的条件与方法,点样于SPR芯片上,然后根据前面的检测方法,分析患者的血清样本与供者机采血小板的相容性。我们对SPR技术检测的其中10位血小板抗体阳性患者,进行交叉配合试验,从多位血小板供者中选择配合型血小板输注,经过临床随访分析,其中8例患者1h血小板增加值CCI>7.5,24hCCI>4.5,为输注有效,并且病人状态良好,另外2例因有其它基础疾病。10、FCM检测结果表明：CITP患者糖皮质激素治疗前,血小板计数均数为28×109/L,外周血Th1、Th17、Th22细胞百分率明显上升,调节性B细胞(Breg)的比例降低,与正常对照比较差别有统计学意义(P<0.05)；经过治疗4天后,血小板计数上升,均数为71×109/L,CITP患者外周血Thl、Th17、Th22细胞百分率明显下降,调节性B细胞(Breg)的比例上升,与正常对照组比较,它们均无显著性差异(P>0.05)。CITP患者外周血Th1、Th17、Th22细胞比例变化与血小板数成负相关性(P<0.05)；调节性B细胞(Breg)的比例变化与血小板数成正相关性(P<0.05)。11、ELISA法测定结果显示,与正常对照组比较,CITP患者糖皮质激素治疗前外周血PBMC细胞培养上清液IFN-y、IL-17、IL-22水平升高,IL-10的表达水平均降低,差别有统计学意义(P<0.05)；糖皮质激素治疗后,与正常对照组比较,均无显著性差异；CITP患者Breg细胞的比例变化与PBMC培养上清中细胞因子IL-10表达水平成正相关(P<0.05),IL-10水平与IFN-γ、IL-17、IL-22水平也呈负相关性(P<0.05)。12、SPR芯片技术检测显示：CITP患者PBMC培养液中分泌的相关细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-17、IL-22水平,结果与ELISA法比较,无显著性差异(P>0.05)。13、成功建立特异性细胞因子-SPR芯片检测平台：运用SPR新型表面化学蛋白芯片先捕获CD4+T细胞,再研究分析芯片上细胞的活性与纯度均大于90%,CD4细胞与IFN-y与相应抗体均有良好的特异性反应,动态分析它们在芯片表面培养刺激产生的IFN-y水平,检测到信号的时间比试管培养刺激的时间更短,特异性更好,该方法具有更进一探索研究的价值。研究结论1、利用表面引发聚合反应技术活性可控的优点,在纳米尺度上调控高分子的相关参数,搭建了一个基于Poly(OEGMA-co-HEMA)的SPR生物传感器的化学表面基质,实现了抗蛋白质非特异性吸附的效果,降低了背景噪音。2、利用分子自组装技术构建了SPR芯片动态性环糊精表面,利用环糊精在聚乙二醇链上的自由转动和滑动的能力,实现动态型的生物传感器表面,从而提高了探针的空间自适配功能,提高了其空间的选择性,实现了动态型的生物传感器表面的制备,为蛋白分子的检测提供了新平台。3、FCM法分析表明：CITP患者Breg细胞的比例下降,且与IL-10的水平呈正相关,与血小板抗体PAIgG的水平呈负相关性。该研究为CITP的发病机制提供了新的思路。4、新型的SPR芯片技术高通量、快速、灵敏地检测CITP患者的血小板抗体的水平与血小板配型输注,经临床随访分析效果良好,表明新型SPR芯片技术可初步应用于CITP患者血小板抗体的检测与配型。5、研究表明CITP患者Breg、Th1、Th17、Th22细胞及其相关细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-17、IL-22分泌紊乱在CITP发病中发挥重要作用,该研究为CITP的临床诊断与疗效评价提供了新靶点。6、新型SPR蛋白芯片技术可用于CITP患者细胞因子的联合检测,高通量、快速地分析其免疫紊乱的特征。建立了新型SPR芯片捕获CD4+T细胞、特异性分析细胞因子IFN-γ变化的平台,更有利于CITPI临床诊断的准确性,具有重要的研发价值。7、该研究为CITP免疫紊乱的临床诊断与疗效评价提供了新靶点和新方法,新型环糊精表面SPR芯片在高通量、快速、特异、联合检测血小板抗体和细胞紊乱中具有重要意义。
【作者】伍昌林；
【导师】王前；
【作者基本信息】南方医科大学，临床检验诊断学（专业学位），2014，博士
【关键词】新型SPR蛋白芯片；慢性特发性血小板减少性紫癜；调节性B细胞；血小板抗体；细胞因子紊乱；临床诊断；

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