神经细胞mTOR通路抑制在实验性帕金森病发生中的作用及分子机理研究

【摘要】本文采用基因克隆、RNA干扰、WesternBlot、免疫组化分析等细胞分子生物学技术方法,以PC12细胞和原代神经元及小鼠为实验对象,通过建立的离体细胞和在体动物PD模型,深入研究了神经细胞mTOR信号通路抑制在帕金森病发生中的作用,探讨了PD发生中PTEN、PDK1、Akt和AMPK功能活性状态与mTOR信号通路抑制诱导神经细胞凋亡的关系及其机制。结果如下：1PD发生中神经细胞mTOR信号通路抑制诱导凋亡以PC12细胞或原代神经元为实验对象,选用6-OHDA、MPP+和鱼藤酮(Rotenone)作为PD模型诱导剂。6-OHDA以0-240μmol/L处理神经细胞12h,或用120μmol/L6-OHDA处理神经细胞0-24h,MPP+和Rotenone分别以1mmol/L和1μmol/L处理神经细胞12和/或24h；采用腺病毒干扰过表达nTOR、持续激活S6K1表达或用慢病毒shRNA干扰下调4E-BP1表达。我们显示,6-OHDA以剂量和时间依赖方式诱发神经细胞mTOR及其介导的S6K1和4E-BP1磷酸化抑制和细胞死亡,MPP+和Rotenone显示类似的抑制作用；三种诱导剂均诱发神经细胞Caspase-3及其下游PARP激活；过表达mTOR、持续激活表达S6K1及干扰4E-BP1表达均部分地阻止PD模型中神经细胞凋亡。提示：PD发生中神经细胞mTOR信号通路抑制诱导凋亡2PD发生中神经细胞PDK1和Akt涉及mTOR通路抑制诱导凋亡以PC12细胞或原代神经元为实验对象,选用6-OHDA、MPP+和Rotenone作为PD模型诱导剂。6-OHDA以0-240μmol/L处理神经细胞24h,或用120μmol/L6-OHDA处理神经细胞0-24h,MPP+和Rotenone分别以1mmol/L和1μmol/L处理神经细胞12和／或24h；采用腺病毒干扰过表达Akt。结果显示,6-OHDA以剂量和时间依赖方式诱发神经细胞PTEN、PDK1和Akt磷酸化抑制,这种抑制作用在MPP+和Rotenone处理的神经细胞也存在；三种诱导剂均抑制神经细胞Akt磷酸化和活性关联凋亡；过表达Akt均部分的阻止由6-OHDA、MPP+和Rotenone诱导的神经细胞凋亡。提示：PD发生中神经细胞PDK1和Akt涉及mTOR通路抑制诱导凋亡。3PD发生中神经细胞AMPK激活介导mTOR通路抑制诱导凋亡以PC12细胞或原代神经元为实验对象,选用6-OHDA、MPP+和Rotenone作为PD模型诱导齐6-OHDA以0-240μmol/L处理神经细胞24h,或用120μmol/L6-OHDA处理神经细胞0-24h,MPP+和Rotenone分别以1mmol/L和1μmol/L处理神经细胞12和/或24h；采用AMPK特异性抑制剂CompoundC预处理PC12细胞2h以抑制AMPK的活性。我们观察到,6-OHDA以剂量和时间依赖方式诱发神经细胞AMPKa激活,类似的,MPP+和Rotenone也激活神经细胞AMPKa;CompoundC能够阻滞6-OHDA、MPP+、rotenone诱导神经细胞AMPKa激活和凋亡；我们发现,运用CompoundC通过抑制AMPKa活性削弱6-OHDA、MPP+、Rotenone诱导神经细mTOR通路抑制保护细胞抗凋亡。提示：PD发生中AMPK激活涉及mTOR信号通路抑制导致神经细胞凋亡。4小鼠PD模型中大脑Akt/AMPK介导mTOR通路抑制诱导神经细胞凋亡以C57BL小鼠为实验对象,采用MPTP诱导小鼠亚急性PD模型。将60只健康成年雄性C57BL小鼠随机分为两组,实验组：MPTP溶于生理盐水(2mg/ml)以30mg/kg体重,每天腹腔注射；对照组：等体积0.9%生理盐水腹腔注射。两组小鼠分别连续注射5d,并在第1、3、5d注射24h后及最后1次注射后第5、10、20d分别随机取实验组及对照组中各5只小鼠进行脑组织匀浆,分别标记Day-5、Day-3、Day0、Day5、Day10、Day20。采用Westernblotting检测脑组织PDK1、Akt、AMPK以及mTOR及其介导的下游分子以及Capase-3和PARP蛋白表达变化。结果表明,小鼠PD模型脑组织mTOR信号通路抑制诱导凋亡；PDK1、Akt磷酸化表达下降；AMPKa磷酸化增加。提示：小鼠PD模型中大脑Akt抑制和AMPK激活关联mTOR信号通路抑制诱导神经细胞凋亡。
【作者】徐一娇；
【导师】陈龙；
【作者基本信息】南京师范大学，生物化学与分子生物学，2013，博士
【关键词】神经细胞；小鼠；PDK；Akt；AMPK；mTOR；帕金森病；凋亡；

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