嗜热真菌脂肪酶基因的克隆、表达及定向进化

【摘要】易错PCR方法,建立了含有9654个转化子的突变体库。通过三丁酸甘油酯平板透明圈法、小量发酵和大量发酵法筛选突变体库。最终获得9个突变菌株,经发酵酶活测定发现酶活最高提高到原始菌株的1.24倍,没有达到预期的效果。同时利用易错PCR方法对疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)脂肪酶LN进行定向进化。采用易错PCR方法,建立了含有11736个转化子的突变体库。通过筛选,最终获得2株酶活力分别是野生菌酶活力3.4倍和2.2倍的突变体菌株：GS-LN4和GS-LNl1。对突变体菌株测序并与野生菌株基因比较发现,GS-LN4中有4个碱基发生改变,其中2个位点引起氨基酸变化,它们是A96V,Q132R;GS-LN11中基有7个碱基发生变化,其中引起7个氨基酸变化,分别是E16D,D50V,L98F,R130K,F147Y,N231D,T236S。对这两个工程菌株进行发酵,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等步骤,得到了纯化的突变蛋白并测定酶活。通过酶学性质与野生菌进行比较,结果发现突变酶在最适反应温度、最适反应pH值和热稳定性等方面都有所改变。并通过同源建模,分析了突变脂肪酶酶活提高和热稳定性改变的可能机制。
【作者】李萌；
【导师】李多川；
【作者基本信息】山东农业大学，经济微生物学，2014，博士
【关键词】嗜热子囊菌光孢变种；疏棉状嗜热丝孢菌；脂肪酶；毕赤酵母；定向进化；

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