姜黄素对人鼻咽癌细胞放射增敏作用及其机制研究

【摘要】研究背景与目的鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤之一,占全国恶性肿瘤死亡的2.81%。据WHO估算,中国NPC发病占全世界80%以上,其中又以中国南方地区发病率为最高,如广东、广西、湖南等省,特别是广东珠江三角洲和西江流域发病率最高,高发区发病率15～30/10万人口,死亡率18.46/10万人口。在治疗上,目前以放射治疗为主,放射治疗后鼻咽癌的平均5年生存率为50%-60%。但鼻咽癌早期症状并不明显,70%患者确诊时已属晚期,而晚期鼻咽癌(Ⅲ、Ⅳ)的5年生存率更低,约10%-40%,治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。作为一种剂量依赖型肿瘤,治疗过程中通过提高局部放射剂量可提高鼻咽癌的局部控制率及生存率,但由于接受放射治疗患者会出现放射反应,特别是急性放射反应,明显影响了患者的生活质量和放射治疗的进程,给患者造成极大的损害和痛苦。因此,寻找有效的放射增敏药物对于预防放射副反应具有重要意义。目前常用的放射增敏剂有5-氟尿嘧啶和顺铂,其在杀死肿瘤细胞的同时也对正常的组织细胞产生了毒性作用,从而限制了其在临床上的应用。为了提高鼻咽癌患者的总的生存率,寻找一种安全低毒的放射增敏药物并阐明其增敏机制,具有重要的临床价值和科学意义。姜黄素(Curcumin,Cur)是从姜科姜黄属植物中提取的一种多酚类化合物,临床前研究以及Ⅰ期临床研究表明姜黄素具有广泛的药理活性：具有抗细胞增殖、抗肿瘤血管生成等作用,可以调节机体的抗药性和耐辐射性,促进伤口愈合,并对糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、心血管疾病、肺部疾病以及关节病有显著的治疗效果。既往研究表明,姜黄素既具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,同时也具有肿瘤放射增敏效应,但姜黄素对鼻咽癌的增敏作用及其机制尚不清楚。鉴于此,本课题拟对姜黄素的放射增敏作用及其机制进行研究。国内外研究证实多药耐药基因1(multidrugresistancegene1,MDRl)与放射敏感性密切相关。宋鹏等证实照射使体外培养的肿瘤细胞的MDR1mRNA表达增强,并对放疗也产生了耐受,表明过表达MDR1使细胞获得放射抵抗性。MDRl的表达受多种因素调控,而microRNA靶向参与MDR1表达调控的研究未见报道。前期研究中,我们证实microRNA可调控MDR1表达。因此,本项目通过体内和体外实验,在证实姜黄素对鼻咽癌是否具有放射增敏作用的基础上,进一步研究MDR1等相关蛋白的表达,探讨microRNA靶向调控MDR1及其参与鼻咽癌放射增敏的可能性。长链非编码RNA(IncRNA)是指转录本长度大于200nt(nucleotide)且不翻译成蛋白质的功能性RNA分子。IncRNA能够影响特定基因座编码的靶蛋白的表达,调节蛋白结合因子的活性,引导染色质修饰复合物的定位以发挥其作用,并且能够通过转录后加工产生大量具有5’帽子结构的小RNA。近年来研究表明,IncRNA与许多癌症的发生和发展密切相关,如膀胱癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等。前期研究中我们发现给予姜黄素处理后,部分IncRNA的表达发生变化。那么在鼻咽癌中,是否有IncRNA的参与及其作用机制,是我们本研究中拟解决的问题。研究内容与方法1.姜黄素对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖的抑制作用采用体外培养的人鼻咽癌CNE-2细胞,以MTT法检测姜黄素对CNE-2细胞的细胞毒作用。将不同浓度的姜黄素分别加入到CNE-2细胞培养液,其终浓度分别为5,10,20,40μM,并设立溶剂对照组。加药后分别培养24h和48h,检测吸光度(OD值),并根据存活分数计算出半数抑制浓度。2.克隆形成实验检测姜黄素对CNE-2细胞放射增敏作用实验分为照射组和照射+姜黄素组,胰酶消化细胞后制成单细胞悬液,逐级稀释后以适当密度接种于6孔板中,完全培养液中培养10-14天,待形成明显的细胞集落时甲醇固定30min,PBS清洗后姬姆萨染色10min,显微镜下计算含50个细胞以上的克隆数,根据公式得出存活分数,分别按单击-多靶模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线,计算放射生物学参数Do、Dq、α、β比较姜黄素对CNE-2细胞的增敏作用。3.流式细胞术分析CNE-2细胞周期采用流式细胞术研究姜黄素对CNE-2细胞周期的影响,实验时分成4组：即对照组,照射组,姜黄素组,照射+姜黄素组(10μM),给予处理后,培养24h后PI溶液染色,流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化,证实姜黄素或辐射(IR)是否会引起CNE-2细胞的G2期阻滞。4.人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤模型的建立采用细胞悬液法造模,造模成功后按肿瘤体积大小将雄性裸鼠随机分成5组,每组6只：模型对照组(生理盐水)、姜黄素组(100mg/kg)、照射组(4Gy)、照射联合姜黄素组低剂量组(100mg/kg)和高剂量(125mg/kg)组,观察肿瘤的生长情况,并绘制裸鼠移植瘤的生长曲线。5.荧光定量PCR检测MDRl和miR-593基因表达分别提取CNE-2细胞和裸鼠肿瘤组织内总RNA,逆转录成cDNA后用引物进行PCR扩增,荧光定量PCR(quantitativePCR,qPCR)检测组织和细胞中MDRl和miR-593的表达。以2-ΔΔCt值表示基因相对表达强度。6.Westernblot检测MDR1蛋白表达提取肿瘤组织中总蛋白、BCA蛋白定量法检测总蛋白浓度后按照SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、显影和定影的步骤进行Westernblot检测。7.双荧光素酶报告基因检测系统进行荧光素酶活性分析转染前一天,将293FT细胞(2×105)接种到24孔板中,每孔加入500gL无抗生素的培养基,待细胞融合度达到95%时进行转染,转染48h后收集裂解细胞并检测双荧光素酶活性,以Fireflyluciferase与Renillaluciferase的活性比值作为双荧光素酶的相对活性8.IncRNA基因芯片结果分析基因芯片技术筛选上调或下调2倍以上差异IncRNA,挑选出AK294004等6个差异明显IncRNA,qPCR技术验证结果。9.AK294004与CCND1的调控关系研究生物信息学技术预测AK294004的靶基因,过表达实验,siRNA和双荧光素酶报告系统验证AK294004与CCND1的结合位点。结果1.不同浓度的姜黄素作用人鼻咽癌CNE-2细胞,在24h、48h时均呈浓度依赖性。其24h、48h半数抑制浓度(IC50)分别为：.32.006μmol/L,11.854μmol/L。2.克隆形成实验结果表明姜黄素降低了受照射后的CNE-2细胞的克隆形成率。据存活分数拟合细胞存活曲线计算出的表示放射敏感性的指标Do、Dq、SF2均提示姜黄素素提高了放射敏感性。放射增敏比(SER)按单击-多靶模型计算为1.33。3.流式细胞检测细胞周期的结果显示照射导致了CNE-2细胞的G2/M期阻滞(P<0.05)。给予10μMCur处理24h,G1期细胞比例显著减少p<0.05),G2细胞比例仪轻微增加,姜黄素与IR联合作用时,与对照组相比,G2期细胞比例显著增加,S期细胞比例显著减少(p<0.05)。4.人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤模型实验结果表明：对照组、照射组、姜黄素组(100mg/kg体重)及照射联合姜黄素低剂量组(100mg/kg体重)及高剂量组(125mg/kg体重)的瘤重分别为(0.83±0.17)g、(0.75±0.23)g、(0.55±0.27)g、(0.47±0.11)g和(0.53±0.23)g,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。各组移植瘤的体积随时间均呈增大变化,对照组的增长幅度最大,以对照组为参照,药物组、照射组及姜黄素联合照射组(100mg/kg)抑瘤率分别为33.73%、9.63%和43.37%,差异有统计学意义(P<0.05)。5.qPCR结果表明,细胞和组织中,照射组MDR1mRNA表达均显著增高,而照射联合姜黄素组MDRl表达显著下降(t=2.918,P=0.019；t=2.682；P=0.028)。而miR-593的表达与其相反,即照射组miR-593表达明显下降,而照射联合姜黄素组miR-593表达显著上调(t=2.918,P=0.019；t=-2.863,P=0.021)。6.Westernblot结果表明,与对照组相比,照射组MDR1表达显著增高(P<0.05).而照射联合低剂量姜黄素组与MDR1表达显著下降,表明姜黄素可逆转照射后MDR1的表达(P<0.05)。7.pGL3-MDR13’UTR和miR-593共转染可显著降低荧光素酶的活性(P<0.01),而将该重组质粒与miR-593inhibitor共转染后可显著增强荧光素酶的活性(P<0.01)。表明miR-593与MDR13’UTR可特异性结合。8.共筛选出在照射和照射联合姜黄素后CNE-2细胞中含量差异显著、且明显上调或下调的蛋白编码基因2480条、1ncRNA基因2795条。qPCR证实AK294004等6个1ncRNA的差异表达与基因芯片结果一致。9.过表达实验中,与对照组(pCDNA3-NC)相比,AK204004的表达增加了3.16倍(t=-13.477,P<0.001),CCND1的表达下降了46%(t=-12.499,P<0.001);RNA干扰实验中,与对照组(siRNA-NC)相比,siRNA-2干扰后,AK294004的表达下降了67%；siRNA-1干扰后,AK294004的表达下降了75%,同时CCND1的表达分别增加了1.34倍和1.48倍,实验结果表明AK294004靶向CCND13’UTR。进一步确认AK294004与CCND13’UTR的结合位点,我们通过荧光素酶报告系统进行了验证,在pGL3-W或pGL3-E1载体中,与pcDNA3-NC相比,pcDNA3-AK荧光素酶活性显著下降(t=8.600,P=0.001;t:4.753,P=0.009);而在pGL3-vector或pGL3-E2载体中,与pcDNA3-NC相比,pcDNA3-AK荧光素酶活性没有显著性差异(t=1.817.P=0.143;t=1.298,P=0.264),表明AK294004的外显子1与CCND13’UTR结合靶向调控CCND1。结论1.通过克隆形成实验及人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤模型,证实姜黄素在体内外对鼻咽癌有放射增敏作用。2.通过Westernblotting,RT-PCR证实姜黄素能逆转MDR1、miR-593的表达,双荧光素酶报告系统明确miR-593靶向MDR13’UTR。证实姜黄素靶向调控593逆转MDR1表达而实现放射增敏。3.通过基因芯片技术筛选出AK294004的等6个差异表达的lncRNA,过表达实验和siRNA技术、双荧光素酶报告系统证实AK294004靶向CCND1,证实姜黄素靶向调控AK294004逆转CCND1表达而实现放射增敏。
【作者】范昊宁；
【导师】佟丽；范钦；
【作者基本信息】南方医科大学，中药学，2014，博士
【关键词】姜黄素；放射增敏；鼻咽癌；MDR1miR-593IncRNACCND1；

【参考文献】
[1]易向军,菅志刚,马家海.数据挖掘技术在核磁共振谱谱图库中的应用[J].计算机与应用化学,2004,03:453-455.
[2]王呈.列车自动驾驶控制模型参数辨识及其应用[D].北京交通大学,2015.
[3]张磊.色满酮肟酯类和苯甲酰基硫脲类化合物的合成及生物活性研究[D].河南农业大学,农药学,2012,硕士.
[4]何青.供应链管理视角的企业物流网络构造研究[D].江西财经大学,企业管理学,2004,硕士.
[5]任源杰.高校思想政治教育微博载体研究[D].西南政法大学,思想政治教育,2012,硕士.
[6]毕文姬,陆丹琴,符莹,黄齐林,徐志爱,张文.基于AuNPs/PDDA-GO纳米复合物的电化学免疫传感器的构建及对SirT1蛋白的检测[J].高等学校化学学报,2013,07:1612-1616.
[7]石小蕊.N糖基化修饰对B7-H3生物学功能影响的初步研究[D].苏州大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[8]邹林峰.基于移相全桥发射机电源的研究[D].西南交通大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[9]袁静雪.我国中小型商业银行风险及管理研究[D].江西农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[10]纪鹏宇.基于半导体光放大器的多波长光纤激光器的优化设计[D].山东大学,2014.
[11]张月红.青钱柳叶三萜类化合物提取纯化、分离鉴定及其抑菌活性研究[D].江西农业大学,农产品加工及贮藏工程,2012,硕士.
[12]史冬梅.沙蛰毒素的毒理学研究[D].青岛大学,皮肤性病学,2004,硕士.
[13]魏茂繁,邵云海,钟卫鸿.生物合成聚-β-羟基丁酸(PHB)的研究现状与应用前景[J].黑龙江科学,2014,06:24-25.
[14]龙男男.中西诚信文化比较研究[D].哈尔滨工业大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[15]华烨.基于相对关系亲密度的局部社团发现算法研究[D].中国科学技术大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[16]高攀科.白血病淋巴瘤患者分子遗传学异常与预后相关性研究[D].苏州大学,内科学,2014,硕士.
[17]史广泉.添加剂与流加操作辅助变性溶菌酶复性动力学[D].天津大学,生物化工,2004,硕士.
[18]戴戈.汽车音响市场剧变中的Car-Hifi论坛运营研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[19]李学彪.人工合成聚合物传递shRNA-IGF1R特异性抑制兔平滑肌细胞增殖迁移的体内外实验研究[D].浙江大学,心胸外科,2014,硕士.
[20]刘虹.英语水平对非英语专业大学生英文写作中动名词搭配错误的影响[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[21]郭振.通用科技项目管理平台的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[22]陈征,高岩.切换系统的二类共同Lyapunov函数[J].控制与决策,2013,04:623-626+631.
[23]徐姗姗.青年马克思的人本主义哲学研究[D].中共中央党校,马克思主义哲学,2013,硕士.
[24]廖瑞金,刘骁,刘捷丰,高竣,夏桓桓,周年荣.现场变压器油纸绝缘时频域介电特征量提取及状态评估[J].电力系统自动化,2015,05:94-100.
[25]陶文静.厦门主题餐厅的文化氛围营造研究[D].华侨大学,旅游管理,2014,硕士.
[26]王新宁.HRB400钢筋混凝土梁抗弯性能的试验研究及有限元分析[D].天津大学,结构工程,2004,硕士.
[27]杜云艳,周成虎,邵全琴,苏奋振,史忠植,叶施仁.案例推理的地学应用背景和方法[J].地球信息科学,2002,01:98-103.
[28]马芳芳.陆地棉超高强纤维发育进程及其蛋白质组分析[D].南京农业大学,作物,2013,硕士.
[29]刘文杰.多主元高熵合金的制备及结构与性能研究[D].东北大学,材料学,2010,硕士.
[30]刘佳.基于模糊集方法的贫困问题分析[D].兰州大学,区域经济学,2013,硕士.
[31]张云.矩阵不等式、项秩及子空间之间的夹角[D].华东师范大学,运筹学与控制论,2014,博士.
[32]唐曦.国家治理，国家审计与国家经济安全[D].云南财经大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[33]高阳阳.基于大介孔碳构筑的电化学传感器及其应用[D].东北师范大学,2014.
[34]简双.LED用高纯氧化铝粉体的细化与烧结工艺的研究[D].东华大学,材料工程（专业学位）,2014,硕士.
[35]张斌.房地产企业借壳上市研究：概貌、模式、绩效[D].浙江财经学院,会计学,2013,硕士.
[36]阮航.简单遗传算法在FPGA中的应用研究[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[37]吴小燕.我国商业银行信贷风险管理研究[D].武汉理工大学,会计学,2012,硕士.
[38]吴春珠.特异水泵试车目击记[J].江苏纺织.1994(07)
[39]周永务,王圣东.非对称信息下供应链库存系统Pareto优化模型[J].控制与决策,2008,10:1163-1167.
[40]苏文鹏.冷战后韩蒙关系的发展及其影响[D].青岛大学,国际关系,2013,硕士.
[41]钟英杰,沈忠良,邓凯,王明晓.化学当量比对声场作用下三区火焰动力学行为的影响[J].燃烧科学与技术,2014,04:290-296.
[42]张宁.天然橡胶的纳米增强及球状无机纳米粒子增强天然橡胶中的逾渗行为[D].青岛科技大学,2009.
[43]陈学法.锰酸锌的制备及其电化学行为研究[D].华中科技大学,材料学,2013,硕士.
[44]孙培培.Navier-Stokes方程的唯一连续性[D].华中科技大学,应用数学,2013,硕士.
[45]王春晓,李俊民.不确定关联大系统对时变参数的自适应控制[J].控制与决策,2004,06:687-690.
[46]周卫,张开富,潘凯,曲阳,王蕾,田国辉,蒋保江,任志宇,李明霞,付宏刚.高热稳定性多孔二氧化钛/石墨烯复合体的制备与光催化性能研究[J].中国科技论文,2014,12:1414-1417.
[47]顾培.基于laponite-石墨烯复合膜的生物电极构筑及其传感性能研究[D].扬州大学,2013.
[48]吴瑕杰,王顺亮,宋文胜,方辉,冯晓云.基于FPGA的三电平空间矢量脉宽调制算法半实物实验方案[J].电力系统自动化,2014,03:78-82+88.
[49]依乐娜.内蒙古地区梅毒防治研究（1950-1965）[D].内蒙古大学,中国近现代史,2014,硕士.
[50]韩敏,徐俏,赵耀,杨溪林,林东.基于微粒群算法的转炉合金加入量多目标优化模型[J].控制与决策,2010,12:1901-1904.