PARP-1依赖性程序性细胞死亡（Parthanatos）在布比卡因致SH-SY5Y细胞损伤中作用的研究

【摘要】局麻药(localanesthetics,LA)是神经阻滞及术后镇痛的常用药物,但随着局麻药的广泛应用,关于其毒性反应的报道也逐渐增多。因此局麻药的细胞毒性成为近年来的研究热点,研究者们试图以此阐明其机制从而指导局麻药所致周围神经损伤的治疗。研究表明,布比卡因是最具毒性的局麻药,可能通过氧化磷酸化解偶联(uncouplingofoxidativephosphorylation)、活性氧(reactiveoxygen,ROS)生成增加及三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)生成减少等引起细胞的凋亡及坏死。凋亡是细胞程序性死亡的一种,主要通过激活半胱天冬酶-3、7(caspase-3、7)而裂解细胞活性相关蛋白,并引起凋亡特有的形态学改变。经典的细胞凋亡信号转导通路可以分为两种：分别是外源性通路(extrinsicpathway)和内源性通路(intrinsicpathway)。前者即死亡受体途径,由细胞表面的死亡受体如肿瘤坏死因子受体(tumournecrosisfactorreceptor,TNF-R)等介导,以激活caspase-8、10为主；后者也称为线粒体途径(mitochondrialpathway),主要是通过线粒体释放细胞色素-c(cytochrome-c)至胞浆并激活caspase-9。两条通路最终都能激活caspase-3和caspase-7。Unami等研究证实,在布比卡因所致的细胞毒性中,caspase-8、9及caspase-3均被激活,且与凋亡小体、DNA碎片的形成正相关,这意味着caspase依赖性内、外源性凋亡通路均与布比卡因的细胞毒性有关。但Perez等研究发现,布比卡因处理的细胞虽然有caspase的激活,却存在caspase的激活滞后的现象,他们用1mM的布比卡因处理SH-SY5Y细胞10分钟,即有接近50%的细胞死亡,而3小时后才出现caspase的激活。Perez等把这种先于caspase激活的细胞死亡归结为坏死,但随着对细胞死亡研究的深入,Perez所依据的这种基于形态学的“凋亡-坏死”的细胞死亡分类显得过于简单。目前学者们将细胞死亡分为两大类,一类为非程序性死亡,另一类则为程序性死亡。前者即坏死,其特点是不能为细胞信号转导抑制剂所阻断,为被动死亡；后者能为细胞信号转导抑制剂所阻断,为主动死亡。程序性细胞死亡又可以分为两大类：caspase依赖性和非caspase依赖性,前者即典型的凋亡,后者包括自吞噬性程序性细胞死亡、副凋亡(paraptosis)、胀亡等,其最大特点是细胞的主动死亡不依赖caspase的激活。那么,Perez的实验结果是否提示在布比卡因所致的细胞死亡中,存在非caspase依赖性的细胞程序性死亡途径?Parthanatos是新近发现的非caspase依赖性细胞程序性死亡。Parthanatos的特点为多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)依赖性,其主要表现为PARP-1激活及随后的细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD+)水平的降低。在Parthanatos中,PARP-1的激活起到关键作用。PARP-1是PARP家族成员中被广泛研究的细胞内的酶类,大约占细胞内PARP活性的90%以上,生理条件下,PARP-1能为DNA碎片等激活,与受损的DNA结合,主要起到DNA修复酶的作用；在病理条件下,如兴奋性毒素损伤、氧化应激、缺血再灌注损伤中,PARP-1出现过度激活,并水解NAD+,同时生成PAR多聚体。由于NAD+在能量代谢中扮演重要角色,因此细胞内NAD+水平的过度消耗将导致能量代谢衰竭；同时NAD+消耗也将导致继发的细胞损伤如ROS增加、线粒体膜电位降低、细胞核及DNA的损伤等,这些变化将最终导致细胞凋亡及死亡。因此,NAD+水平的降低是Parthanatos中细胞死亡的主要原因,而维持细胞内的NAD+水平,有可能明显降低细胞死亡率。研究表明,外源性NAD+能够通过细胞膜上的P2X7受体门控通道进入细胞,使细胞内NAD+水平显著提升,并以此维持细胞能量代谢而减少细胞死亡率。既然氧化应激能激活PARP-1,而布比卡因能导致细胞ROS增加,且在布比卡因所致的细胞死亡中存在caspase延迟现象,我们有理由推测：在布比卡因所致的细胞死亡中,存在Parthanatos,即因PARP-1的激活而导致的细胞内NAD+水平下降及由此导致细胞死亡；外源性的NAD能维持细胞内NAD+水平并由此减少布比卡因所致的细胞ROS生成增加、线粒体膜电位降低,进而减少细胞凋亡的发生。本研究拟应用SH-SY5Y细胞培养技术,通过检测细胞内PARP-1的表达、PAR含量变化及细胞内NAD+水平的变化,初步明确布比卡因所致的神经毒性中是否存在Parthanatos;同时通过外源性NAD对布比卡因所致的细胞内ROS含量增加、线粒体膜电位降低、细胞核损伤及细胞凋亡的影响,确定外源性NAD是否有助于减轻布比卡因的神经毒性。其目的在于从新的角度探讨在布比卡因神经毒性的机制,为临床上防治局麻药的神经毒性提供实验依据。第1章布比卡因神经毒性是否与多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)激活有关目的明确布比卡因是否导致SH-SY5Y细胞PARP-1激活,其神经毒性是否与激活PARP-1有关。方法以1-10mM布比卡因培养液处理SH-SY5Y细胞30分钟-6小时,以Western-blot法检测细胞内PARP-1及其代谢产物-多聚腺苷二磷酸核糖(Poly-(ADP)ribose,PAR)的表达情况；以100nM、200nM的PARP-1抑制剂-PJ34培养液与5mM布比卡因培养液共同处理细胞30分钟,或单独以5mM布比卡因处理细胞30分钟,光镜下观察其对布比卡因所致细胞形态改变的影响,并以CCK-8法其对细胞存活率的影响。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0统计软件分析。不同浓度布比卡因处理30分钟后细胞内PARP-1及PAR的表达、1mM布比卡因处理0-6小时后细胞内PAPR-1及PAR的表达采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)；PJ34对布比卡因处理后细胞存活率的影响采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果以1～10mM布比卡因处理SH-SY5Y细胞30分钟后,各组细胞PARP-1蛋白表达水平不同,其中5mM及10mM处理组细胞内PARP-1蛋白的表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.011,P=0.006)；各组细胞PAR含量不同,2mM、5mM及10mM处理组均明显高于对照组(P=0.029,P=0.032,P=0.008)。以1mM布比卡因处理细胞0-6小时后,各组细胞PARP-1蛋白表达水平不同,其中布比卡因处理1小时、2小时及4小时后,PARP-1蛋白表达明显高于对照组(P=0.013、P=0.001、P=0.002)；各组PAR含量不同,在布比卡因处理2小时、4小时及6小时后高于对照组(P=0.003,P=0.004,P=0.033)。以5mM布比卡因处理30分钟之后,光镜下可见细胞出现胞体变圆、皱缩、突触减少甚至消失及细胞贴壁性差等形态学变化,提示细胞受到明显的损伤,PARP-1抑制剂PJ34干预后,较少出现上述变化；CCK-8细胞存活率检测显示：PJ34处理和布比卡因处理之间存在交互效应(F=7.608,P=0.001),PJ34100nM+5mM布比卡因组及PJ34200nM+5mM布比卡因组细胞存活率分别达到60.01±16.71%、74.00±22.35%,明显高于5mM布比卡因处理组的39.14±12.46%(P=0.007,P=0.000)。结论布比卡因能导致SH-SY5Y细胞内PARP-1的激活,PARP-1激活与布比卡因的神经毒性有关。第2章布比卡因的神经细胞毒性是否与细胞内NAD+水平降低相关目的观察布比卡因是否降低细胞内NAD+水平,细胞内NAD+水平下降是否由PARP-1激活引起,布比卡因神经细胞毒性是否与细胞内NAD+水平降低有关。方法以1～10mM布比卡因培养液处理SH-SY5Y细胞30分钟～7小时,以酶循环法检测SH-SY5Y细胞内NAD+含量,并以CCK-8法检测相同处理条件下SH-SY5Y细胞的存活率；以1～10mM利多卡因培养液处理SH-SY5Y细胞30分钟,以酶循环法检测SH-SY5Y细胞内NAD+含量,以CCK-8法检测细胞死亡率；以100nM、200nM的PARP-1抑制剂-PJ34培养液与5mM布比卡因共孵育30分钟,或单独以5mM布比卡因处理细胞30分钟,以酶循环法检测对照组、5mM布比卡因组、100nMPJ34组及200nMPJ34组细胞内NAD+水平的变化；以0.1～10mMNAD培养液预处理SH-SY5Y细胞30分钟,再以5mM布比卡因细胞30分钟,以酶循环法检测各组细胞内NAD+水平的变化；并以100μMP2X7受体抑制剂-Ox-ATP培养液预处理SH-SY5Y细胞30分钟后,再以0-10mMNAD培养液处理细胞30分钟,或直接以0～10mMNAD培养液处理细胞30分钟,以酶循环法检测细胞内NAD+水平；以1～10mMNAD培养液对SH-SY5Y细胞进行预处理或后处理,分别再以2mM、5mM及10mM布比卡因培养液处理30分钟,以CCK-8法检测各组细胞死亡率。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0统计软件分析。1mM布比卡因处理30分钟～7小时后细胞内NAD+水平的变化及细胞存活率、不同浓度布比卡因、利多卡因处理后细胞内NAD+水平变化及存活率、PJ34干预对布比卡因所致细胞内NAD+水平降低的影响、外源性NAD对细胞内NAD+水平及细胞存活率的影响,均采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)；Ox-ATP对细胞内NAD水平的影响、外源性NAD预处理或后处理对布比卡因处理后细胞毒性的影响采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1mM布比卡因处理后3小时,细胞内NAD+水平开始明显下降,由处理前的100.38±11.87%下降至57.40±3.91%(P=0.000),此后保持逐渐下降的趋势,至处理后7小时,细胞内NAD+水平降至处理前的27.8±8.47%(P=0.000)；不同浓度布比卡因处理30分钟后,细胞内NAD+呈浓度依赖性下降(F=16.827,P=0.004),以2mM、5mM、10mM布比卡因处理细胞30分钟后,细胞内NAD+水平分别降至对照组的21.50±3.15%、25.73±7.22%及16.07±13.93%,明显低于对照组(P=0.043、0.031、0.015)。相同处理条件下,细胞存活率的变化较为缓和：1mM布比卡因处理各时点细胞存活率无明显差异；1～10mM布比卡因处理后,细胞存活率随着布比卡因浓度的增高而降低(F=130.140,P=0.000),其中2mM、5mM、10mM布比卡因组,细胞存活率分别降至对照组的49.44%±8.55%、35.75±15.83%及25.58±4.45%,明显低于对照组(P=0.000、0.000、0.000)。在利多卡因处理组,以10mM利多卡因处理细胞30分钟后,细胞内NAD+水平降至对照组的41.57±1.73%,明显低于对照组(P=0.004)；以5mM、10mM利多卡因处理细胞30分钟后,细胞存活率分别降至对照组的86.56%±11.28%、71.86±12.29%,明显低于对照组(P=0.048、0.000)。以PJ34与5mM布比卡因共同处理细胞后,NAD+水平较5mM布比卡因组明显升高,其中以100nMPJ34及5mM布比卡因处理细胞30分钟后,细胞内NAD+水平虽上升至对照组的69.25±25.25%,但未明显高于单独布比卡因组(P=0.072)；以200nMPJ34及5mM布比卡因处理细胞30分钟后,细胞内NAD+水平升高至对照组的80.81±21.66%,明显高于单独布比卡因处理组(P=0.026),且与对照组相比,差异无统计学意义(P=0.318)。以NAD预处理30分钟之后再以5mM布比卡因处理,细胞内NAD+水平下降较5mM布比卡因处理组缓和,且与对照组相比,差异无统计学意义。其中以2.5mM、5mM、10mMNAD预处理的细胞,其细胞内NAD+水平分别达到对照组的85.87+11.82%、89.21±11.55%及105.05±58.82%,明显高于单独以布比卡因处理的细胞(P=0.043、0.033、0.008)。未行Ox-ATP预处理的细胞,以5mM、10mMNAD处理细胞后,细胞内NAD+水平分别达到对照组的192.87+27.68%及279.37±20.00%,明显高于对照组(P=0.003,P=0.000),且明显高于相同NAD处理条件下的Ox-ATP预处理组细胞(t=-3.248,P=0.031、t=-14.923,P=0.000)。以不同浓度NAD预处理或后处理干预后,细胞存活率明显高于单独以2mM、5mM、10mM布比卡因处理的细胞,且预处理效果好于后处理。结论布比卡因能通过激活PARP-1引起细胞内NAD+水平降低；外源性NAD能通过P2X7受体门控通道进入细胞,并提高细胞内NAD+水平；布比卡因所致的NAD+下降早于细胞死亡的发生,外源性NAD能提高布比卡因处理后的细胞存活率。上述结果提示NAD+水平降低由PARP-1激活引起,且与布比卡因的神经细胞毒性有关。第3章外源性NAD是否能减轻布比卡因所致的细胞损伤目的观察不同处理条件下,NAD+对布比卡因所致的细胞内ROS增加、线粒体膜电位衰减及核损伤的影响,并明确外源性NAD是否能由此减少布比卡因所致的细胞凋亡。方法以1～10mMNAD预处理SH-SY5Y细胞30分钟,然后以1mM布比卡因处理3小时,以流式细胞仪(FCM)检测细胞内DCFH-DA探针含量,由此确定细胞内ROS含量；以FCM检测JC-1多聚体／单体比值,以观察线粒体膜电位的变化；以FCM检测AnnexinV-FITC及PI染色后各组细胞的凋亡率,以Hochest33258核染色观察核固缩率。结果以1mM布比卡因处理3小时后,细胞内ROS含量为对照组的1.67±0.15倍,明显高于对照组(P=0.000)；以1～10mMNAD预处理30分钟后,再以相同条件的布比卡因处理SH-SY5Y细胞,细胞内ROS含量分别为对照组的1.43±0.09倍、1.43±0.05倍、1.46±0.13倍及1.20±0.07倍,明显低于单独布比卡因处理组(P=0.017、P＝0.017、P=0.033、P=0.000)。布比卡因处理组JC-1多聚体/单体比值为9.49±1.85,明显低于对照组的36.98±6.32(P=0.000)；以5mM、10mMNAD预处理组细胞JC-1多聚体/单体比值升则至33.19±12.95、46.09±10.24,与对照组相比差异无统计学意义(P=0.579,P=0.192),且明显高于单独布比卡因处理组(P=0.003,P=0.000)。布比卡因处理组核固缩发生率高达22.49±2.23%,表现为多处、散在的高亮蓝色荧光,明显高于对照组的6.29±2.12%(P=0.000)；而以2.5mM、5mM及10mMNAD预处理后,核固缩率明显降低,分别降至8.09±2.87%、7.00±1.39%及6.53±0.24%,与对照组相比无明显差异(P=0.319、P=0.688、P=0.894),且明显低于单独布比卡因处理组(P=0.000、P=0.000、P=0.000)1mM布比卡因处理组细胞早期凋亡率为18.73±1.66%,明显高于对照组的5.40±0.69%,1mM、2.5mM及5mMNAD预处理组细胞早期凋亡率分别为10.87±0.49%、7.80±0.61%及7.10±0.17%,已明显低于布比卡因处理组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),10mMNAD预处理组细胞早期凋亡率降至6.10±0.52%,与对照组相比,差异无统计学意义(P=0.323),且明显低于布比卡因处理组(P=0.000);1mM布比卡因处理组细胞晚期凋亡率为5.70±0.70%,明显高于对照组的1.00±0.30%,1mMNAD预处理组细胞晚期凋亡率明显低于单独布比卡因处理组(P=0.000),2.5mM、5mM及10mMNAD预处理组细胞晚期凋亡率分别降至1.67±0.67%、1.50±0.30%及1.27±0.39%,与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.247,P=0.379,P=0.3247),且明显低于单独布比卡因处理组(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。结论NAD预处理、后处理均能减少布比卡因所致的ROS生产增加、线粒体膜电位降低及核固缩等细胞损伤,并最终减少了布比卡因所致的细胞凋亡,且预处理组效果优于后处理组。
【作者】郑艇；
【导师】徐世元；
【作者基本信息】南方医科大学，麻醉学，2014，博士
【关键词】布比卡因；多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶；程序性细胞死亡；细胞毒性；

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