新型多重荧光探针法检测常见肺炎链球菌血清型的临床应用研究

【摘要】肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)是人类最早认识的革兰阳性双球菌,从新生儿至儿童期SP的定植率可达30～100%,导致人类各种肺炎链球菌相关性疾病(Pneumococcaldisease,PD):如全身严重侵袭性感染,以及局部粘膜感染,是全球范围内最常见和首要的导致社区获得性肺炎(Community-acquiredpneumonia,CAP)的病原体。儿童和长者、慢性病、酗酒、免疫力低下者易出现SP的严重感染和高病死率,PD是5岁以下儿童的首要死因,全球每年约100万婴幼儿死于该病,其中发展中国家受累最重,非洲、亚洲儿童PD的死亡率占全球的95%,我国PD死亡儿童人数列全球前10名以内,由于人口流动、多重耐药性传播等因素,全球PD负担尚在不断加重,防治压力巨大。SP强大的致病和定植能力与其实际存在超过90种的血清型(serotype)/变种(variant)有关,决定血清型特异性的是SP细胞外包绕的荚膜多糖(Capsularpolysaccharide,CPS),是SP最重要的毒力因子和致病的关键,其可作为宿主抗体的作用靶点,这也是疫苗应用的基础。迄今,根据SP的不同CPS结构,采用免疫学方法已经鉴定出46个血清群(serogroup),93个血清型。SP的血清型与其致病性、耐药性和疫苗有效性等均密切相关,是防治PD相关研究的核心。全球范围内,13种血清型导致了超过75%的儿童侵袭性PD(Invasivepneumococcaldisease,IPD);多项研究显示SP多重耐药菌(Multidrugresistance,MDR)在全球广泛流行,亚洲国家最显著,我国MDRSP高达80～90%以上,由于选择压力,流行血清型更具有耐药性,为更好的控制耐药流行SP的传播,目前已有多种针对不同血清型的疫苗,可供2岁以下儿童使用的7价结合疫苗(Pneumococcalconjugatevaccine,PCV)全球应用最早最广。应用PCV7之初,显著降低了IPD的发病率及耐药血清型的流行,随后全球各地均出现不同程度的SP非疫苗血清型(Nonvaccineserotype,NVT)增加,总体PD的发病率不再显著降低,疫苗的有效性和研发新型疫苗是目前国际相关研究关注的焦点。SP的血清型分布流行特点尚具有显著的地域、年龄差别,并随时间、环境变迁、人群流动、抗菌素压力、细菌进化和重组等多种因素出现不同时期流行血清型的飘移(Serotypeswift),因此,持续监测SP的血清型流行分布及改变特征,与研究SP的致病机制、耐药性传播、血清型置换等实验和临床研究都息息相关,对防治PD具有重要的流行病学意义。目前检测SP血清型的金标准是通过126种CPS兔抗血清,采用棋盘筛选方式,将SP进行血清分群和分型(可以区分91种血清型),但检测费用极昂贵,并且手工操作复杂、费时,结果判断主观,均限制其在大部分临床实验室的应用,不能适应以发展中国家和地区为首的对血清型检测的广泛需求。随着SP的93种血清型的cps序列的公布,各种分子分型技术有望替代传统方法,针对cps序列不同靶基因的多种聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)再辅助后续的不同产物分离以区分不同血清型的分子方法不断被探索。其中,美国CDC推荐采用的多重PCR(mutiple-PCR,mPCR)检测SP血清型的方案较为经济、快速、灵活和有效,目前得到全球多个研究者的采用,该方案最大的缺点是一次mPCR包括的引物对仅2-4对,需要7-8次连续mPCR才能鉴定出多种血清型,且通过电泳分析产物容易造成污染。因此,本研究拟建立并完善高通量、高特异性且简易经济、可靠客观的检测SP血清型体系使其能广泛应用于临床实验室。多重连接酶依赖的探针扩增法(MultiplexLigation-dependentProbeAmp-lification,MLPA)是一种针对多种待检DNA序列进行定性和半定量分析的基于特异性探针连接的PCR新技术,基本原理包括探针和靶序列DNA进行序列特异性杂交,连接酶连接、通用引物对所有完成连接的序列进行PCR扩增,产物分离及数据分析,其特点是在一次反应中通过多重特异性探针可检测40-50个核苷酸序列,连接酶保证反应的特异性,且后续只需要一个通用引物即可进行PCR扩增,具有高通量、高特异性和简易经济的特点,目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究,包括染色体非整倍体改变,单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)和点突变,多种呼吸道病毒的检测,尚未见报道用于细菌血清型分型检测。MLPA的技术难点在于设计特异性杂交探针,模板DNA必须与两条特异性探针(长探针和短探针)均完全互补才能进行后续的连接和PCR扩增,因此可检测出一个碱基的差异,理论上很适于检测SP不同血清型cps间具有的异质性差异,MLPA后续产物的分析通常采用毛细管凝胶电泳,根据产物的大小区别,检测成本较高,耗时并有开盖产物污染风险。本课题组对MLPA探针及后续产物分析进行改进,通过设计新型的基于与MLPA长探针上的填充序列相同的具有特定Tm的值荧光检测探针加入体系以标记不同MLPA探针反义链,在PCR扩增完成后,通过不同的荧光检测探针的融解曲线分析检测是否有相应血清型扩增产物,实现单管不开盖检测产物,极大的优化实验步骤,使其更适于临床菌株血清型检测。本研究结合PCV7疫苗血清型和国内已有流行血清型分布研究结果,建立并完成优化常见的十种血清型的新型多重荧光探针法检测体系,一次完成对血清型4、6、9V/9A、14、15A/F、15B/C、18(18A/18B/18C/18F、19A、19F、23F的检测,并对其进行临床菌株应用评价。第一章建立新型多重荧光探针法检测肺炎链球菌血清型体系首先,参考美国CDC网站(http://www.cdc.gv/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)公布信息,构建了十种血清型特异性PCR检测体系和3个mPCR检测体系,并构建完成十种血清型特异性质粒用于后续实验标准品；通过检测二十种已知血清型、SP血清型特异性质粒完善和优化检测体系,以完成对十种血清型的PCR对照检测,使其可以应用于临床菌株血清型对照检测。其次,建立新型多重荧光探针法检测十种血清型体系：设计十种血清型特异性MLPA探针、十种血清型特异性荧光检测探针,两种内标MLPA探针及荧光检测探针。血清型特异性MLPA探针由左探针和右探针组成,左探针包括一段通用引物结合序列和一段血清型特异性寡核苷酸(LPO),右探针包括一段血清型特异性寡核苷酸(RPO)、一段填充序列(该序列与荧光检测探针序列相同)和一段通用引物结合序列。LPO和RPO序列部分的Tm值为70度左右,RPO的5’端磷酸化。当LPO和RPO杂交序列与待检测DNA特异性互补杂交,经连接酶连接后,左右两探针相连成为一个完整模板DNA,在通用引物的作用下,经不对称PCR扩增出大量产物DNA和与模板DNA互补的单链DNA。该杂交序列是参考美国CDC网站(http://www.cdc.gv/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)公布的特异性血清型引物序列,再通过BLAST获取扩增产物序列,在产物序列里面筛选Tm值恰当,无SNP位点为杂交序列。填充序列为与链球菌基因组无特异性结合的序列,不同填充序列与荧光探针对应,其Tm为特定值,用于区分不同扩增产物。通用引物结合序列参考文献确定,填充序列参考文献根据(G+C)的Tm值确定。血清型特异性荧光检测探针序列与填充序列相同,其3’-最后一个碱基标有ROX/CY5荧光基团。全体系中只有1对通用引物,设计为不对称PCR,检测体系中还包括杂交缓冲液、连接PCR体系。整个体系实验流程包括杂交探针与靶DNA杂交,连接酶将已杂交的LPO和RPO连接,PCR完成对整个MLPA探针序列进行扩增,荧光融解曲线分析血清型荧光检测探针完成对血清型特异性产物的检测。再次,完成优化新型多重荧光探针检测体系并评估其灵敏度、特异性和重复性：应用SP血清型特异性质粒、二十种已知血清型(包括十种检测体系内血清型和十种检测体系外血清型)SP菌株及多种其它非SP菌株DNA作为检测标准,对整个体系及实验流程的进行优化,优化完成体系的检测灵敏度为103copies/ml,确定荧光探针融解曲线峰值>0.1为阳性血清型特异性峰；可正确分辨出所有十种已知血清型,每个已知血清型检测结果均具有3个阳性峰：血清型特异性峰,两个内标峰；采用十种检测体系外血清型和其它非SP菌株DNA进行特异性检测,未发现血清型特异性检测峰及内标峰,特异性良好,4个浓度重复检测十种已知血清型菌株DNA显示均能检测出相同阳性结果,重复性良好。本研究建立的新型多重荧光探针法检测常见SP血清型体系符合临床检测SP血清型的简易、高效、经济、高通量的要求,实现不开盖单管完成对十种血清型检测,初步估计应用该体系检测一株SP的血清型造价是采用传统金标准方法检测的十分之一以上,检测时间约3小时,有很好的临床应用前景。第二章新型多重荧光探针法检测肺炎链球菌血清型的临床应用评价本研究对临床收集的侵袭性SP菌株30例、呼吸道SP菌株180例分别进行4种方法(传统方法、新型多重荧光探针法、mPCR法、血清型特异性PCR+测序法)和3种方法(新型多重荧光探针法、mPCR法、血清型特异性PCR+测序法)检测十种血清型,以评估新型多重荧光探针法检测SP菌株血清型的临床应用价值。30例侵袭性SP菌株血清型检测结果显示,新型多重荧光探针法一次可以检测出全部菌株血清型共6种：9例19F(30%)、7例23F(23.3%)、7例14型(23.3%)、3例6型(10%)、2例15B(6.7%)、2例19A(6.7%),一份样本只检出一种血清型,检测敏感性为100%,每种血清型的检测特异性为100%,结果与其他三种方法完全一致,完成对所有菌株血清型的检测需进行3次mPCR；180例呼吸道SP菌株血清型检测结果显示,新型多重荧光探针法一次可以检测出93.3%菌株的血清型(168/180),其中检出19F最多,占29.4%(53),其次为：23F16.1%(29)、6型15%(27)19A11.7%(21),15B5.6%(10)、14型3.3%(4),15A、18C、9V、4各占0.6%(1),检出两种血清型混合感染占10%(18),未检出相关血清型6.7%(12),新型多重荧光探针法与金标准血清型特异性PCR+测序方法检测结果无显著性差异,一致性强(Kappa=0.845,P=0.000),与mPCR方法检测结果无显著性差异,一致性强(Kappa=0.863,P=0.000);新型多重荧光探针法和mPCR法检测呼吸道SP菌株十种血清型的准确性相同,敏感性97.6%、特异性100%、阳性预测值100%、阴性预测值75%。新型多重荧光探针法检测呼吸道菌株单种血清型感染的敏感性、特异性均为100%,mPCR法的检测敏感性、特异性为98.6%、100%。对22例具有两种血清型混合感染菌株分析显示,以6/19F混合感染最多(12),23F可与多种血清型混合感染(共4种),新型多重荧光探针法和mPCR方法对混合感染的菌株血清型检测敏感性均为81.8%(18/22),特异性均为100%(158/158),阳性预测值均为100%(18/18),阴性预测值新型多重荧光探针法、mPCR法为97.6%(158/162)、98.8%(160/162)；新型多重荧光探针法与mPCR方法检测混合血清型的一致性好(Kappa=0.941,P=0.000),两方法无显著性差异(McNemarP=0.5);新型多重荧光探针法与金标准法检测混合血清型的一致性好(Kappa=0.888,P=0.000),两方法无显著性差异(McNemarP=0.125)。经分别比较侵袭性和呼吸道SP菌株检出血清型6、14、19F、23F、15B、19A的阳性率,血清型14在侵袭性菌株中的阳性率23.3%显著高于呼吸道菌株中的阳性率3.3%,差异有显著性(x2=14.435,v=1,P=0.001),其他血清型在两种样本中分布未见显著性差异。不包括检出混合血清型,三组mPCR方法每一组mPCR分别检出侵袭性SP菌株血清型覆盖率为36.7%、46.7%、16.7%,三组mPCR方法每一组mPCR分别可检出呼吸道SP菌株血清型覆盖率为39.4%、19.4%、21.1%。4种检测血清型方法中,本研究新型多重荧光探针法平均花费约10元／例,远低于传统方法167元／例,检测十种血清型完成时间最快3小时,远比测序法3天时间短,只需要一次PCR,采用荧光定量PCR仪直接观察结果,无污染、高通量,操作最简单。检测临床菌株的准确性与mPCR法一致,整个体系稳定,适用于临床大量SP菌株的血清型初筛检测。第三章深圳市宝安区临床SP菌株检出血清型分布特点与疫苗覆盖率本研究采用血清型1/3/5/7F特异性PCR补充检测第二章中的未知血清型菌株,对第二章中的临床SP菌株检出血清型进行分布特点与疫苗覆盖率的流行病学分析,结果显示：首先,侵袭性菌株和呼吸道菌株检出血清型的PCV7/13疫苗覆盖率较高,分别为86.7%/93.3%和74.4%/86.1%(细分两种混合感染血清型结果后),不同样本类型的疫苗覆盖率之间没有显著性差异；呼吸道菌株检出两种混合感染血清型能被PCV7和PCV13覆盖的比例相同,均为81.8%,两种混合感染血清型分别表现为6+19F/6+23F/23F+19F,其余18.2%不能完全被PCV7或PCV13覆盖,如排除两种混合感染血清型结果,则侵袭性菌株的PCV7/13疫苗覆盖率均显著高于呼吸道菌株；其次,侵袭性和呼吸道SP中非PCV7疫苗血清型分布特点：侵袭性SP中共计4例为非PCV7疫苗血清型(13.3%),其中有PCV13疫苗血清型19A2例与非PCV13疫苗血清型15B2例；呼吸道SP中共计46例为非PCV7疫苗血清型(25.6%),其中有PCV13疫苗血清型19A(43.5%)和5型(2.2%)共计45.7%；其他非PCV13疫苗血清型共计54.3%,其中与15B有关的可达26.1%(包括15B+23F2.2%,15B+19A2.2%,15B21.7%),与15A有关的占4.4%(15A+23F),与PCV7疫苗血清型23F有关的占6.7%(15A+23F4.4%,15B+23F2.2%)；与19A有关的共计45.7%(19A43.5%,15B+19A2.2%)；非PCV13未知型(除外15A/15B)23.9%。因此,通过本研究方法对临床菌株血清型的检测,能基本阐述本地区菌株的血清型分布特点,说明本研究方法对临床菌株的血清型的检测具有重要的流行病学分析的价值。
【作者】吴丽娟；
【导师】王前；
【作者基本信息】南方医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】肺炎链球菌；血清型；多重连接酶依赖的探针扩增；荧光探针聚合酶链反应；融解曲线分析；分子分型；

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