HIF-1α抑制剂YC-1对缺氧条件下U87细胞血管生成拟态的影响

【摘要】研究背景和目的脑胶质瘤约占脑内肿瘤的40%～50%,具有高侵袭性、高度增殖性,传统手术加放、化疗等综合治疗手段主要针对的是肿瘤细胞,疗效欠佳,而一直以来所采用的抗肿瘤血管生成的治疗策略也未见明显疗效。1999年,Maniotis等发现了血管生成拟态现象(vasculogenicmimicry,VM),即肿瘤细胞可以在特定情况下模拟血管内皮细胞形成一种功能上类似于正常血管的通道,形成另一肿瘤供血系统,提示抑制这一血供可能成为肿瘤血管靶向治疗的新靶点。血管生成拟态现象的发现,为胶质瘤综合治疗提供了更多的思路和方法。有关VM形成机制目前尚未十分明确。最新的研究认为,VM形成与肿瘤微环境改变密切相关。深入研究胶质瘤微环境的改变将有助于进一步了解VM形成机制,探讨治疗方法的多样性和有效性。肿瘤微环境指的是肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与肿瘤细胞共同构成的局部内环境。缺氧与细胞外基质构成了微环境的主要组成内容；而细胞间质高压形成、组织缺氧和酸中毒、大量生长因子和蛋白水解酶的产生等构成了肿瘤组织代谢环境的生物学特征。这种特性对于肿瘤的增殖、侵袭、新生血管的形成、凋亡等均具有重要影响。缺氧是肿瘤微环境重要的组成部分。肿瘤细胞的生长和增殖有赖于充分的氧气和能量供应。当肿瘤细胞失控性生长和增殖时,消耗了大量的营养和氧气。由于尚未及时建立有效的新生血管网,或新生血管网的结构和功能处于异常状态,氧的供应远少于氧的需求,肿瘤细胞处于急性(灌注缺乏)或慢性(弥漫障碍)缺氧状态。而缺氧状态下,由于多种分子的作用,进一步影响了肿瘤细胞的增殖、新生血管形成、凋亡等生物学行为。目前发现,这些分子主要包括有缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、基质金属蛋白酶(MMP)、整合素、钙粘连素、免疫球蛋白类粘附分子、选择素、抗凋亡蛋白等。缺氧状态下,这些分子也参与了肿瘤细胞VM的形成,包括有HIF-1α、MMPs、VEGF、Bcl-2等。研究发现,HIF-1α参与多种实体肿瘤VM的管道形成,主要通过以下途径：(1)HIF-1α能够调控EphA2/PI3K/MMPs信号途径影响VM形成。张诗武等对人眼葡萄球黑色素瘤VM形成过程研究中,发现在缺氧环境下,肿瘤细胞高表达HIF-1α,可上调MMP-2和MMP-9分子表达,降解ECM,促进肿瘤细胞浸润和VM形成；(2)HIF-1α还能够受到PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响参与调控VM的形成。有研究发现mTOR特异性抑制剂雷帕霉素能够抑制卵巢癌细胞中的HIF-1α,提示雷帕霉素通过调控PI3K/AKT/mTOR及HIF-1α途径影响VM形成。由此可见,HIF-1α在VM形成过程中扮演了非常重要的角色,对HIF-1α的深入研究及多靶点联合抑制HIF-1α将是我们未来抗血管生成拟态形成的重要研究方向。B细胞淋巴瘤/白血病-2分子(B-celllymphoma-2,Bcl-2)也被证实影响人眼葡萄球黑色素瘤细胞VM形成。实验显示,缺氧微环境中Bcl-2与VEGF表达上调；当沉默Bcl-2后,VEGF表达明显下调,VM形成明显受抑制。因此,Bcl-2也可能是抑制肿瘤细胞VM形成的靶点。近年来,有学者报道了缺氧对脑胶质瘤VM管道形成的影响。2011年张熙等发现胶质瘤细胞SHG44在缺氧条件下形成的血管生成拟态中,VEGF、EphA2、MMP2、MMP9表达明显增强,提示缺氧条件下,HIF-1α有可能通过影响VEGF、EphA2、MMPs等分子表达来参与VM的形成。2012年奚再兴等报道缺氧能促进胶质瘤U251细胞VM形成,诱导HIF-1α和VEGF-A的表达可能是其作用机制之一。由此可见,HIF-1α、MMPs、抗凋亡蛋白等多种分子在胶质瘤VM形成中起着重要作用。在肿瘤的靶向治疗中,VM相关分子特异性抑制剂的作用日益受到重视。其中,HIF-1α特异性抑制剂3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-1-苯甲基吲唑{3-(5-hydroxymethl-2-furyl)-1-benzylindazole,YC-1}被证实对多种肿瘤如胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌等具有优越的抗血管新生活性及肿瘤治疗活性,并呈现有剂量依从性。而Bcl-2特异性抑制剂也被认为是抗血管新生的有效药物之一,通过调控Bcl-2表达从而影响VM的形成。目前未见YC-1影响胶质瘤VM形成的报道,但有研究已证实了YC-1可影响胶质瘤的血管新生。2012年,意大利MariziaB教授对诱导缺氧条件下胶质瘤细胞U87的细胞生长、血管新生等细胞生物学改变进行了研究。结果表明YC-1通过抑制HIF-1α分子的表达,进一步抑制MMPs分子表达,从而减少了U87细胞的血管新生。因此,缺氧如何影响胶质瘤U87细胞VM形成,以及应用HIF-1α特异性抑制剂YC-1能否抑制缺氧胶质瘤细胞VM形成,都值得我们探讨。本研究采用化学模拟缺氧法诱导人胶质瘤U87细胞缺氧微环境,探讨缺氧条件下U87细胞VM形成及相关分子的表达。随后,应用不同浓度YC-1对HIF-1α进行抑制,探讨YC-1影响U87细胞VM形成情况及相关分子表达,并分析其可能机制。最后,应用YC-1及Bcl-2特异性抑制剂,探讨双药物多靶点治疗对缺氧胶质瘤U87细胞VM的抑制作用及可能机制。研究目的为改进抗恶性胶质瘤血管生成策略提供新的思路,为寻找联合作用靶点奠定基础,从而扩展治疗手段,提高胶质瘤治疗生存率。第一章缺氧对胶质瘤U87细胞VM形成及相关分子的影响目的构建模拟缺氧胶质瘤U87细胞实验模型,观察U87细胞的血管生成拟态情况,分析HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2等相关分子表达,为研究模拟缺氧U87细胞血管生成拟态的作用机制及HIF-1α靶向抑制治疗提供基础。方法人胶质瘤U87细胞进行常规培养、三维培养。建立对照组和缺氧组。缺氧组每孔加入二氯化钴(CoCl2)100μmol/L。两组24h终止培养。观察各组细胞的管状结构排列情况和完整程度：用倒置显微镜下(×100)随机取上、下、左、右、中心5个视野摄像记录并计数管状结构的总长度,取每个视野的均值。应用RT-PCR技术检测两组HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子的表达。结果血管计数：24小时培养后对照组细胞生长序列紊乱,无明显规律,仅能发现少数的网状结构,而缺氧组细胞相互连接,融合形成网状结构,呈单个环或多个环连接的网络样结构。镜下观察,对照组平均每视野网状结构数量为2946.355±114.795μm,缺氧组为4244.161±79.686μm,两组有显著性差异(P<0.05)。RT-PCR检测：(1)对照组HIF-1α为2.888±0.187,缺氧组为6.723±0.419,组间有显著性差异(t=-14.483,P<0.05)。(2)对照组MMP-2为4.077±0.676,缺氧组为4.636±0.51,组间无显著性差异(t=-1.143,P>0.05)。(3)对照组MMP-14为2.766+0.074,缺氧组为4.995±0.313,组间有显著性差异(t=-12.014,P<0.05)。(4)对照组Bcl-2为2.796+0.249,缺氧组为3.772±0.953,组间有显著性差异(t=-6.349,P<0.05)。结论缺氧能促进U87细胞VM形成。缺氧条件下可能通过上调细胞HIF-1α分子表达,进一步调节MMP-14,Bcl-2分子的表达,可能与缺氧胶质瘤U87细胞VM的形成相关。第二章不同浓度YC-1对缺氧胶质瘤U87细胞VM形成及相关分子表达的影响目的观察应用不同浓度YC-1对缺氧胶质瘤U87细胞VM形成的影响,探讨不同YC-1实验浓度对缺氧胶质瘤肿瘤细胞血管生成拟态相关分子表达的影响。方法人胶质瘤U87细胞经常规培养及三维培养,依照常氧或缺氧条件下加入0、10、50umol/L的YC-1分为常氧对照组、常氧YC-1-10组、常氧YC-1-50组、缺氧对照组、缺氧YC-1-10组、缺氧YC-1-50组共六组。缺氧组每孔加入二氯化钴(CoCl2)100μmol/L。所有细胞组经培养24h后终止培养。观察加入YC-1组VM形成情况并与对照组比较。提取各组U87细胞的RNA。RT-PCR检测各组HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表达的差异。用Westernblot技术分析各组U87细胞HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2的活性程度。结果血管计数：缺氧24h培养后,加入YC-1后可见少数的网状结构,较未加入YC-1者减少；YC-1-10组血管网状结构较YC-1-50组平均每视野网状结构数量显著减少(P<0.05)。常氧24h培养后,加入YC-1后可见极少数的网状结构,较未加入YC-1者减少；YC-1-10组血管网结构较YC-1-50组的平均每视野网状结构数量显著减少(P<0.05)。RT-PCR检测：(1)加入YC-l后,缺氧组与常氧组之间HIF-1α分子表达有显著差异(F=104.001,P<0.001)。YC-1均显著下调常氧组与缺氧组内HIF-1α分子的表达,在常氧组呈剂量依从性(P<0.05),而缺氧组无剂量依从性(P>0.05)。(2)加入YC-1后,缺氧组与常氧组之间MMP-2分子表达无显著差异(F=2.353,P=0.151>0.05).YC-1均显著下调常氧组与缺氧组内MMP-2分子的表达,常氧组无剂量依从性(P>0.05),缺氧组有剂量依从性(P<0.05)。(3)加入YC-1后,缺氧组与常氧组之间MMP-14分子表达有显著性差异(F=35.515,P<0.001).YC-1均显著下调常氧组与缺氧组内MMP-14分子的表达,常氧组有剂量依从性(P<0.05),缺氧组无剂量依从性(P>0.05)。(4)加入YC-1后,缺氧组与常氧组之间Bcl-2分子表达有显著差异(F=25.816,P<0.001)。YC-1均显著下调常氧组与缺氧组内Bcl-2分子的表达,两组均有剂量依从性(P<0.05)。Westernblot技术检测：(1)加入YC-1的常氧组及缺氧组经培养24h后,可见HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子减少。(2)加入不同浓度的YC-1后,常氧条件下Bcl-2蛋白无明显差异；缺氧条件下高浓度的YC-1组内MMP-2、Bcl-2分子表达低于低浓度YC-1组。结论YC-1对缺氧胶质瘤U87细胞VM形成有抑制作用,随浓度增大而增强。YC-1显著下调缺氧胶质瘤U87细胞HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子的表达；YC-1对MMP-2、Bcl-2的抑制效果随YC-1作用浓度增大而增强。第三章YC-1与Bcl-2抑制剂对缺氧人胶质瘤U87细胞VM形成的影响及可能机制目的观察应用YC-1、Bcl-2抑制剂(ABT-737)对缺氧胶质瘤U87细胞VM形成的影响,研究HIF-1α及ABT-737对相关分子表达的影响,进一步探讨缺氧U87细胞VM的机制及多靶点治疗的意义。方法细胞分为对照组、YC-1组、ABT-737组、(YC-1+ABT-737)双抑制组。诱导缺氧培养24h。观察各组细胞的管状结构排列情况和完整程度,计算管状结构的总长度。应用RT-PCR及Westernblot技术检测各组HIF-1αMMP-2、MMP-14、Bcl-2分子的表达。结果血管计数：(1)四个组间之间VM总长度有显著性差异(F=105.267,P<0.001).YC-1组、ABT-737组、YC-1+ABT-737组VM总长度依次为2836.638±151.301μm,3815.453±22.917μm,2484.528±164.137μm,均显著少于对照组(P<0.05)。(2)与YC-1+ABT-737双抑制组比较,YC-1组或ABT-737组的VM总长度均有显著性差异(P<0.05)。RT-PCR检测：(1)四个组别之间比较：HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表达均有显著性差异(P<0.001)。(2)实验组与对照组相比,HIF-1αMMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表达均显著下调(P<0.05)。(3)与YC-1+ABT-737双抑制组比较：YC-1组及ATT-737组内的HIF-1α、MMP-2、Bcl-2分子表达均有显著性增加(P<0.05)；ATT-737组内MMP-14分子表达显著性增加(P<0.05),但YC-1组MMP-14分子表达无显著性差异(P>0.05)。Westernblot检测：(1)与对照组相比,YC-1组、YC-1+ABT-737组的HIF-1αMMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表达均下降；ABT-737组的MMP-2、Bcl-2分子表达下降,但HIF-1α、MMP-14分子无明显下降。(2)与(YC-1+ABT-737)双抑制组相比,ABT-737组的HIF-1α、MMP-14分子表达升高；YC-1组的HIF-1α、MMP-2、MMP-14分子无明显差别,但Bcl-2分子表达较高。结论单纯加入YC-1、单纯加入ABT-737或同时加入YC-1与ABT-737,均可显著抑制缺氧胶质瘤U87细胞VM形成；同时加入YC-1及ABT-737者抑制VM形成更显著。Bcl-2是抑制缺氧胶质瘤U87细胞VM形成的一个有效靶点。YC-1联合ABT-737的双药物多靶点治疗,抑制VM形成效果优于单药物治疗。双抑制作用可能通过显著下调HIF-1α、MMP-2、Bcl-2分子的表达来完成。
【作者】李建文；
【导师】柯以铨；
【作者基本信息】南方医科大学，神经外科学，2014，博士
【关键词】胶质瘤；U87；细胞；血管生成拟态；缺氧诱导因子-1α；YC-1；基质金属蛋白酶；B细胞淋巴瘤/白血病-2；基因；肿瘤靶向治疗；

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