磷酸二酯酶-4介导的信号通路在酒精依赖中的调节作用

【摘要】目的：酒精滥用和成瘾是影响着个人和社会发展的全球性健康问题,不仅危害着饮酒者个人的身心健康,而且严重威胁着社会和经济的发展。酒精依赖是一种复杂的慢性疾病,从初次饮酒到持续饮酒,最后发展为酒精依赖,这一过程伴有神经递质、离子通道和受体功能及其介导的信号通路的神经适应性改变。环磷腺苷(cAMP)作为体内极其重要的第二信使之一,其介导的信号通路在酒精依赖形成过程中发挥着关键作用。急性酒精刺激直接或间接提高腺苷环化酶(AC)活性,增强cAMP依赖信号而产生急性酒精效应,但长时间反复饮酒导致cAMP信号通路发生适应性改变,酒精对cAMP依赖信号刺激作用减弱,这可能与中断饮酒后出现的急性酒精戒断症状有关。此外,研究发现杏仁核内磷酸化-cAMP-反应元件结合蛋白(pCREB)和脑神经生长因子(BDNF)水平低下导致动物饮酒量和酒精偏爱度增加,这可能与pCREB和／或BDNF水平低下动物焦虑水平较高有关,提高pCREB和BDNF水平可缓解焦虑症状并减少饮酒量和酒精偏爱度。细胞内cAMP水平的稳态由AC和磷酸二酯酶家族(PDEs)共同调节,然而关于AC-cAMP在酒精依赖中的调节作用研究已有很多,但PDEs-cAMP是否参与调节酒精依赖不得而知。PDEs包含11个家庭成员,其中磷酸二酯酶-4(PDE4)特异性水解cAMP,是调节脑内cAMP水平稳态最重要的酶,在阿尔茨海默病、脑缺血以及抑郁症等中枢神经系统疾病中发挥重要作用。咯利普兰作为PDEA选择性抑制剂一方面可有效改善认知损伤动物的学习记忆能力,另一方面产生抗焦虑抗抑郁样作用。此外,抑制PDE4还可减少小鼠饮酒量和偏爱度。因此,基于cAMP依赖信号通路在酒精依赖中发挥重要的调节作用,以及PDE4调节细胞内cAMP水平,本课题借以咯利普兰作为研究PDE4工具药,应用多种动物模型和分子生物学实验研究PDE4介导的信号通路在酒精依赖中的调节作用,具体内容：1.PDE4在酒精奖赏效应和强化效应中的调节作用；2.PDE4在自行饮酒及急性酒精戒断中的调节作用；3.PDE4在急性应激诱发戒酒复饮行为中的调节作用。方法：1.PDE4在酒精奖赏效应和强化效应中的调节作用。①PDE4抑制剂对酒精诱导的条件性位置偏爱(CPP)的获得和表达的影响。CPP实验分为基础值前测阶段(1d)、条件性位置偏爱训练阶段(2-9d)和测试阶段(10d)。根据基础值前测阶段的结果将8周龄雄性C57BL/6J小鼠均匀随机分为溶剂(1%DMSO)+生理盐水组(Veh+Sal),溶剂+酒精组(Veh+EtOH),咯利普兰0.5mg/kg+生理盐水组(Rol+Sal),咯利普兰0.5mg/kg+酒精组(Rol+EtOH),溶剂+生理盐水+咯利普兰0.5mg/kg组(Veh+Sal+Rol)和溶剂+酒精+咯利普兰0.5mg/kg组(Veh+EtOH+Rol).Veh+Sal,Veh+EtOH,Rol+Sal和Rol+EtOH组用以评价咯利普兰对CPP获得的影响,在训练过程中给药。Veh+Sal,Veh+EtOH,Veh+Sal+Rol和Veh+EtOH+Rol组用以评价咯利普兰对CPP表达的影响,在测试30min前给药。结果以对伴药箱的偏爱度表示。②PDE4抑制剂对酒精诱导行为敏化(locomotorsensitivity)获得和表达的作用。行为敏化实验分为基础值前测阶段(1-2d)、急性刺激阶段(3d)、敏化阶段(4-13d)和测试阶段(14d)。根据基础值前测阶段的结果将8周龄雄性C57BL/6J小、鼠均匀随机地分为溶剂(1%DMSO)+生理盐水组(Veh+Sal),溶剂+酒精组(Veh+EtOH),咯利普兰0.5mg/kg+生理盐水组(Rol+Sal),咯利普兰0.5mg/kg+酒精组(Rol+EtOH)和溶剂+酒精+咯利普兰0.5mg/kg组(Veh+EtOH+Rol)。Veh+Sal,Veh+EtOH,Rol+Sal和Rol+EtOH组用以评价咯利普兰对行为敏化获得的影响,敏化阶段进行给药。Veh+Sal,Veh+EtOH,Rol+Sal和Veh+EtOH+Rol组用以评价咯利普兰对行为敏化表达的影响,在测试30min前给药；为评价咯利普兰对酒精吸收和代谢的影响,实验结束后采血,采用顶空-气相色谱-质谱联用法检测全血血液酒精浓度。2.PDE4在自行饮酒和急性戒断症状中的调节作用及咯利普兰的干预作用。8周龄雄性C57BL/6J小鼠适应环境1w后,单笼饲养,自行选择饮用10%酒精(v/v)溶液3w,根据饮酒量和酒精偏爱度将小鼠随机分为溶剂(1%DMSO)组和咯利普兰(0.25和0.5mg/kg)组。采用twobottlechoice实验和drinkindark实验测定PDE4抑制剂对自行饮酒行为的影响。戒断12h后进行旷场实验和明暗箱实验以测定咯利普兰对急性酒精戒断引起的焦虑反应的作用。恢复饮酒3d后,将小鼠断头取脑,分离前额皮层、纹状体和杏仁核,RT-PCR法检测长期饮酒后脑组织内PDE4各亚型mRNA的变化,以及咯利普兰的干预作用；Westernblotting法检测长期饮酒对脑组织cAMP依赖信号通路的影响以及咯利普兰的作用；HPLC法检测PDE4酶活性。3.PDE4在急性应激诱发戒酒复饮行为中的调节作用。8周龄雄性C57BL/6J小鼠适应环境1w后,单笼饲养,连续给予10%酒精3w,根据饮酒量和酒精偏爱度将小鼠均匀随机地分为Non-EtOH+Non-stress组,Non-EtOH+Stress组,EtOH+Non-stress组,EtOH+Stress组和咯利普兰0.5mg/kg+EtOH+Stress(Rol+EtOH+Stress)组。戒酒1w后给以短时、间断性应激,即给以足底电击,10min内给以15次电击。Twobottlechoice实验测定急性应激对小鼠饮酒行为的影响。为评价咯利普兰对应激诱导小鼠饮酒行为的影响,在给以足底电击钱根据分组分别给予溶剂(1%DMSO)或咯利普兰处理。之后进行旷场实验和明暗箱实验分别测试应激对饮酒小鼠自主活动和焦虑水平的影响以及咯利普兰的干预作用。行为学测试结束24h后,断头取脑,RT-PCR法检测应激对长期饮酒小鼠脑内PDE4各亚型mRNA表达的影响以及咯利普兰的干预作用。结果：1.①根据CPP基础值前测阶段的结果,将小鼠非偏爱的白箱作为伴药箱。经过8天4轮回训练后,模型组小鼠对伴药箱的偏爱度明显提高,表明训练后小鼠建立了酒精奖赏效应与伴药箱的关联性,模型制作成功。与模型组相比,训练阶段给以咯利普兰0.5mg/kg显著减少小鼠对伴药箱的偏爱度,表明咯利普兰干扰了酒精的奖赏效应。但测试前给以咯利普兰0.5mg/kg不影响小鼠对伴药箱的偏爱,表明咯利普兰对已获得的奖赏效应与伴药箱的关联性记忆无明显作用。②行为敏化实验中,与基础值相比,低剂量酒精(2.0g/kg)急性刺激显著增加小鼠的活动次数,经过10d的高剂量酒精(2.5g/kg)敏化训练后,小鼠对低剂量酒精刺激反应敏感性增加,表现为自发性活动明显比敏化训练前增多,表明行为敏化模型制备成功。敏化训练过程中,给予咯利普兰0.5mg/kg处理明显减少低剂量酒精刺激引起的活动增加现象,表明咯利普兰干扰了酒精诱导行为敏化的形成。然而,测试前给以咯利普兰0.5mg/kg处理,未见显著影响低剂量酒精刺激引起的活动增加现象,表明咯利普兰对已获得的行为敏化的表达无明显作用。顶空-气象色谱-质谱联用法检测全血酒精浓度结果显示,各组小鼠血液酒精浓度之间无明显差异,表明咯利普兰不是通过影响酒精吸收而产生作用的。2.经训练饮酒3w后,C57BL/6J小鼠饮酒量和酒精偏爱度明显提高并维持在较高水平。两瓶实验中,咯利普兰0.25和0.5mg/kg均减少饮酒量和降低酒精偏爱度,但不影响总液体摄取量,提示咯利普兰减少饮酒并非通过抑制活动所致。在黑暗中饮酒实验中,4h内小鼠饮酒量为4.31±0.56g/kg,咯利普兰0.25和0.5mg/kg均显著减少小鼠的饮酒量。旷场实验中,与未饮酒小鼠相比,酒精戒断小鼠在敞箱中央的活动次数减少,但总水平活动次数和站立次数无明显变化。在明暗箱实验中,酒精戒断小鼠在明箱内停留时间明显缩短,暗箱穿越到明箱内的次数也明显减少,但从明箱内进入暗箱的潜伏期无明显差异,以上结果提示酒精戒断12h后,长期饮酒小鼠表现出强烈的焦虑样反应。咯利普兰0.5mg/kg明显改善酒精戒断引起的焦虑症状。长期饮酒后纹状体内PDE4AmRNA明显提高,而其他PDE4mRNA水平无明显变化。长期饮酒显著提高纹状体内PDE4酶活性,降低纹状体内CREB、ERK1/2和GSK-3β磷酸化水平,但对前额皮层内pCREB和pERK1/2水平无明显影响。咯利普兰0.5mg/kg明显逆转长期饮酒导致纹状体内PDE4酶活性上调现象,显著提高纹状体内pGSK-3β水平,仅轻微提高纹状体内pCREB水平,但对纹状体内pERKl/2和前额皮层内CREB和ERKl/2磷酸化水平均无明显影响。3.连续给酒3w后,小鼠的饮酒量和酒精偏爱度均达到较高且相对稳定的水平。戒酒1w后给予短时、间断性足底电击后,应激小鼠的饮酒量和酒精偏爱度较无应激小鼠明显提高。然而,应激和长期饮酒均不影响小鼠的自主活动(水平运动和垂直运动)。明暗箱实验中,与未应激小鼠相比,急性应激小鼠在明箱内停留时间缩短,且明暗箱穿越次数也显著减少,但明箱穿越至暗箱内的潜伏期无明显差异,表明急性应激增强焦虑反应。与未饮酒小鼠相比,长期饮酒小鼠未表现出明显的焦虑反应,但急性应激显著增加饮酒小鼠的焦虑反应。应激时给予咯利普兰进行干预,小鼠在明箱内的停留时间较给予溶剂小鼠延长,明暗箱的穿越次数也显著增多,提示咯利普兰有效减弱长期饮酒合并应激引起的焦虑样反应,但咯利普兰对小鼠的自主活动以及抑郁样行为无明显作用。Real-timeRT-PCR法检测不同脑区内PDE4mRNA的表达,长期饮酒合并应激显著提高伏隔核内PDE4A、4B及4DmRNA、纹状体内PDE4A及4DmRNA和前额皮层内PDE4AmRNA的水平,给以咯利普兰0.5mg/kg处理显著逆转这一现象。单纯给以应激或饮酒仅显著提高伏隔核内PDE4DmRNA水平。结论：cAMP作为体内极其重要的第二信使之一,其介导的信号通路在长期酒精刺激过程中发生适应性改变是酒精依赖形成和戒断症状的分子基础。我们的研究结果表明,PDE4作为调节脑内cAMP水平最重要的水解酶,在酒精依赖形成过程中发挥关键作用。长期饮酒导致纹状体内PDE4mRNA水平变化,提高纹状体内PDE4酶活性,降低CREB、ERK1/2和GSK-3p磷酸化水平,这可能为促使并维持小鼠饮酒行为的分子机制。急性应激更大程度上地提高了戒酒小鼠多个脑区内PDE4mRNA水平,其中以NAc和纹状体内PDE4mRNA变化最为明显,这可能与应激导致戒酒小鼠饮酒量增多和焦虑水平提高有关。PDE4选择性抑制剂咯利普兰明显抑制了酒精诱导条件性位置偏爱和行为敏化的形成,表明提高cAMP依赖信号可有效对抗酒精的奖赏效应和强化效应。此外,PDE4选择性抑制剂咯利普兰显著减少长期饮酒小鼠和戒酒小鼠急性应激后的饮酒量和酒精偏爱度,缓解急性戒断症状,逆转应激引起戒酒小鼠焦虑反应增加现象。综上所述,PDE4-cAMP信号通路在酒精依赖中发挥重要作用,但PDE4包含四个亚型,除PDE4C主要在外周组织内表达外,其余亚型均在脑内高度表达,究竟PDE4哪个亚型在酒精依赖形成过程中发挥着最为关键的作用仍需进一步研究。我们的行为学结果显示,PDE4特异性抑制剂有良好的抗饮酒行为和抗焦虑样作用,表明PDE4抑制剂有开发为防治酒精依赖药物的潜能,但其确切的作用机制仍需进一步研究。综上所述,本研究不仅充实了PDE4-cAMP-PKA信号通路参与调节药物成瘾的理论基础,而且提供了PDE4抑制剂作防治酒精依赖形成的新治疗策略。
【作者】拱梅芳；
【导师】徐江平；张汉霆；
【作者基本信息】南方医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】酒精依赖；磷酸二酯酶-4；应激；焦虑；条件性位置偏爱；行为敏化；

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