诱导多能干细胞向内皮细胞分化的调控机制及其对心肌梗死的治疗作用研究

【摘要】背景与目的以干细胞治疗为基础的再生医学在缺血性心脏病治疗应用,让人们看到了新的希望。心血管再生医学现阶段的迫切任务是获得具有理想的心血管细胞分化潜能的多能干细胞或祖细胞。其中内皮细胞分化在血管生成的过程起关键作用,在胚胎发育和出生后心血管疾病的发展中扮演重要的角色。从干或祖细胞分化来源的内皮细胞可以应用于各种心脑血管疾病的细胞疗法中,例如血管损伤、中风、冠状动脉心脏疾病和急性心肌梗死。诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcells,iPSC)像胚胎干细胞一样能够很好的维持自我更新和具有广泛的分化潜能,但不存在伦理学问题,具备重要的应用价值。健康或者自体来源的iPSC能分化为各个系统的细胞类型,可以用于修补丢失或损坏的组织。在特定的诱导条件下,iPSC模拟胚胎发育过程,在体外自发分化形成三个胚层,并能分化成功能性的心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、或者血管周细胞,为心肌组织工程在心肌梗死的治疗应用提供了重要的种子细胞来源,并为各细胞类型分化机制研究提供了一个理想的平台。然而iPSC的细胞分化潜能广泛,目前的研究主要是从分化的iPSC中分离感兴趣的细胞亚型做进一步的功能分析。而应用iPSC治疗缺血性心肌梗死疾病的机制比较复杂,除了iPSC向心血管谱系细胞的分化方向和再生功能,还有细胞因子分泌的作用,因此仍不清楚哪种机制直接决定了iPSC的组织修复功能,其中内皮细胞分化潜能对iPSC的治疗机制的直接贡献程度有待进一步阐明。为了明确iPSC向内皮细胞分化与心梗后心肌功能恢复的直接关系,我们利用选择性诱导自杀基因技术方法来特异消除分化的内皮细胞,再观察iPSC治疗心肌梗死作用的变化,以心肌功能恢复的改变来判断iPSC向内皮细胞分化的治疗意义。因为iPSC的生物学特性跟胚胎干细胞非常近似,直接将iPSC移植进入体内,具有形成肿瘤的风险,因此我们需要进一步提高iPSC定向分化的效率。为提高内皮细胞分化效率,我们需要求助于iPSC内皮细胞分化的机制研究,以获得一个有效的策略和方法。microRNA(miRNA)是内源性高度保守的短非编码RNA,其成熟分子大约22个核苷酸长度。成熟的miRNA能特异结合至靶基因mRNA,诱导mRNA降解和/或抑制mRNA的翻译,从而抑制基因的蛋白表达。miRNA成为了基因表达调控的重要因子之一,在胚胎发育和疾病等病理生理过程中具有重要的意义。目前研究表明miRNA对多能干细胞的内皮分化潜能亦具有重要的调控作用。为了发现新的调控iPSC沿内皮细胞方向分化的miRNA,本文通过芯片筛选iPSC分化过程中差异表达的miRNA,主要研究其中与内皮分化相关的miRNA,并通过基因干扰的策略验证miRNA对iPSC内皮细胞分化和效率的影响,并探讨miRNA对其靶基因的调控作用。方法本研究采用体外悬浮胚状体(embryoidbody)法诱导iPSC向心血管细胞分化,胚状体形成后转移贴壁培养体系,流式细胞仪检测a-actinin阳性或CD31阳性细胞比例,而Oct4作为未分化的iPSC标志。利用自杀基因技术验证iPSC内皮细胞分化的意义。建立由血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)启动子诱导的自杀基因(单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK))慢病毒载体(pCDH-VE-TK)及其无启动子的阴性对照载体(pCDH-N-TK)。以前体药物更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)对诱导自杀基因载体进行功能验证,以人脐静脉内皮细胞作为阳性对照,而以未分化的iPSC、成肌细胞和心肌细胞作为阴性对照。通过TK的mRNA和蛋白水平表达,GCV对各种细胞存活的影响进行验证。利用pCDH-VE-TK慢病毒感染建立稳定表达的ipSCVE-TK细胞系。结扎左前降支建立心肌梗死模型,在心梗组织中心和周边部位移植ipSCVE-TK细胞补片(1×106),空膜片作为无细胞移植对照。一周后,通过腹腔注射GCV(10g/kg,生理盐水作为对照),在各个时间点进行超声心动图分析,观察心肌功能各项参数的改变(包括左室舒张末内径(LVEDd)\收缩末内径(LVESd)\左室射血分数(EF)和左室收缩分数(FS))。30天后处死动物,收取心脏标本进行免疫荧光染色(GFP标志移植的细胞,vWF标志内皮细胞),观察移植iPSCVE-TK的血管分化情况。iPSC通过诱导胚状体形成而分化,以miRNA芯片对总RNA测序,比较iPSC分化前后miRNA的表达变化,筛选调节分化的miRNA。通过免疫磁珠分选方法分离表达内皮基因CD31的细胞,以流式细胞仪进行纯化效率的检测,并通过定量PCR分析miRNA在分选细胞的表达变化,从而发现与iPSC内皮细胞分化相关的miRNA。我们通过慢病毒转染干扰miRNA的表达,进一步探讨miRNA对iPSC内皮细胞分化的影响。首先以定量PCR验证慢病毒转染干扰miRNA的效果,然后诱导iPSC分化,并通过管环形成试验(Tubeformation)、免疫荧光检测(内皮基因-VE-Cadherin)、流式细胞仪检测(VE-Cadherin和CD31)和定量PCR检测(VE-Cadherin、eNOS和CD31,动脉内皮细胞基因-Ephrin-B2,静脉内皮细胞基因-EphB4和淋巴管内皮细胞基因-podoplanin)。以硫酸盐PCR甲基化测序检测VE-Cadherin和CD31启动子甲基化状态,以染色质免疫共沉淀PCR方法检测VE-Cadherin和CD31启动子区域的组蛋白修饰。本研究主要利用现行的生物信息学预测方法在TargetScan和miRanda等miRNA数据库进行靶基因的预测,在输出的候选靶基因中,我们主要关注与内皮细胞功能和分化相关的基因,并利用miRNA拟似物和抑制剂通过3’非编码区荧光素酶报告基因系统和Westernblot进行验证。结果本研究iPSC分化成心血管细胞比例大约为80%(心肌细胞：66.5±1.2%,内皮细胞：15.44±0.8%),而没分化的iPSC比例为0.84±0.2%,余下的是其它分化类型。构建自杀基因载体经过测序验证。人脐静脉内皮细胞分别转染pCDH-N-TK和pCDH-VE-TK慢病毒,逆转录PCR和westernblot检测发现,无病毒感染的内皮细胞和感染pCDH-N-TK的内皮细胞不表达TK,而感染pCDH-VE-TK的内皮细胞能特异表达TK的mRNA和蛋白。因此,TK能在特异的血管内皮钙黏蛋白启动子的驱动下表达。我们利用GCV进一步研究TK基因的特异杀伤功能。通过荧光显微镜的观察发现,GCV对感染pCDH-N-TK的内皮细胞生长没有明显的影响,但能明显的杀死感染pCDH-VE-TK的内皮细胞,差异具有统计意义(t=12.73,P<0.001)。未分化的iPSC转染pCDH-VE-TK漫病毒后,GCV处理对其生长没有显著的影响。另外,利用心肌细胞和成肌细胞作为阴性对照,GCV的处理对它们的生长均没有显著的影响。我们通过动物实验结合诱导自杀基因技术研究iPSC移植对心梗心肌功能的恢复情况：将带自杀基因的iPSCVE-TK补片移植进入心梗组织和腹腔注射GCV,并通过超声心电图分析大鼠心肌功能,各组LVEDd、LVESd、EF和FS采用两因素(2×2)析因方差分析。分别在PBS或GCV处理条件下,iPSCVE-TK移植组各项心肌功能参数均比空膜片组的好,差异具有统计学意义(P<0.05)。而在无细胞移植(空膜片)的处理下,GCV对心肌功能没有明显的影响,与PBS的差异没有统计学意义；而当移植iPSCVE-TK后,GCV能够显著地降低iPSCVE-TK组的心肌功能,与PBS组的差异具有统计学意义(P<0.05)。通过免疫荧光染色探讨iPSC在体内的血管分化功能：GFP荧光显示外源性移植的iPSCVE-TK,并能在体内形成新生血管管壁组织,而GCV能够减少其血管新生作用,GFP阳性管腔结构减少,与对照组的差异具有统计学意义(t=6.60,P=0.001);vWF荧光显示内皮细胞,iPSC移植能增加血管密度,而GCV能够减少其促血管新生作用,vWF阳性管腔结构减少,与对照组的差异具有统计学意义(t=4.46,P=0.004)。我们将iPSC分化形成的EB进行miRNA芯片测序,结果信息显示在iPSC自发分化过程中,81个miRNA表达降低至0.5倍以下,138个miRNA表达升高至2倍以上,表达差异均具有统计学意义(P<0.01)。热图显示了未分化和分化的iPSC一部分表达差异的miRNA信息,我们将重点关注调控iPSC内皮细胞分化的候选miRNA、将iPSC诱导分化通过免疫磁珠分离CD31-和CD31+细胞,流式细胞检测结果显示CD31阳性细胞比例达85%。定量PCR检测表明CD31+细胞的CD31、eNOS和VE-Cadherin的表达均比CD31‘细胞的高,差异具有统计学意义(P<0.01)。Westernblot检测表明CD31蛋白在CD31+细胞表达显著增加,而Oct4表达显著降低。通过定量PCR检测9个候选miRNA在未分化的iPSC、分化CD31-和CD31+细胞的表达水平,通过方差分析发现,CD31+细胞的miR-18a-5p(miR-18a)、miR-302a-3p(miR-302a)和miR-495-3p(miR-495)表达比未分化iPSC和CD31-细胞的要低,差异具有统计学意义。但是miR-18a和miR-302a在CD31-细胞的表达也比未分化iPSC低,与iPSC向内皮细胞分化(CD31上调)的方向不一致。miR-495只在CD31+细胞的表达降低,与CD31表达上调相关,可能作为iPSC向内皮细胞分化的负调控因子。进一步通过pZIP-anti-495慢病毒转染干扰iPSC的miR-495功能(iPSCanti-495),探讨其对内皮细胞分化的影响。定量PCR检测表明pZIP-anti-495的转染能够降低iPSC的miR-495表达水平,与pZIP-scramble(iPSCScram)的差异具有统计学意义(t=9.32,P<0.001)。分化的iPSCanti-495种在基质胶上能形成管环网状结构,其管环的长度比iPSCScram的长,差异具有统计学意义(t=5.92,P=0.01)。iPSCanti-495的VE-Cadherin表达比iPSCScram的高,并主要分布在细胞间隙。流式细胞仪检测表明,抑制iPSC的miR-495能增加VE-Cadherin阳性和CD31阳性细胞的比例,与iPSCScram的差异具有统计学意义。定量PCR检测表明分化的iPSCanti-495各种内皮细胞标志(VE-Cadherin,CD31和eNOS)表达比iPSCScram的高,差异具有统计学意义。另外,抑制iPSC的miR-495促进Ephrin-B2的表达,降低podoplanin的水平,与iPSCScram的差异具有统计学意义；而EphB4在iPSCanti-495与iPSCScram的表达没有显著差异。抑制miR-495仅能分别使VE-Cadherin和CD31启动子的数个CpG位点去甲基化,但是作用效果不明显。而抑制miR-495可以促进VE-Cadherin和CD31启动子聚集H3K4me3和Ace-H3,促进了分化的iPSC内皮基因的表达,并能抑制H3K27me3的聚集,去除基因的转录抑制信号。通过miRNA靶基因数据库的预测,我们发现血管内皮锌指蛋白(vascularendothelialzincfinger1,VEZF1)可能是miR-495的一个潜在靶基因。其中miR-495的种子序列与各种属的VEZF1的3’UTR结合位点较为保守。在转染VEZF1的3’UTR报告载体的细胞中,miR-495拟似物组的荧光素酶活性比阴性对照组的低,差异具有统计学意义(t=12.48,P=0.0002)；而细胞转入突变miR-495结合位点的载体后,miR-495拟似物组的荧光素酶活性和阴性对照组的没有显著差异。Westernblot结果表明,miR-495拟似物能降低iPSC的VEZF1表达,而miR-495抑制剂能促进iPSC的VEZF1表达。结论iPSC移植能够改善心梗模型的心肌功能。内皮特异诱导自杀基因的策略对不表达TK的细胞没有明显的影响,而特异消除iPSC分化的内皮细胞,减弱了iPSC修复心肌梗死的功能,表明iPSC向内皮细胞分化对心梗后心肌功能恢复具有重要的作用。但内皮特异诱导自杀基因不能完全地取消iPSC的修复功能,表明iPSC还存在其它的补偿作用机制。在iPSC的分化机制研究中,miR-495可能作为iPSC向内皮细胞分化的负调控因子。抑制miR-495,促进iPSC内皮细胞基因的表达和内皮细胞的分化效率,并能形成管环结构,同时能促进动脉内皮细胞基因的表达,并抑制淋巴管内皮细胞基因的表达。VEZF1作为miR-495一个潜在靶基因,可能参与了抑制miR-495促进iPSC内皮细胞分化的作用机制。因此,通过抑制内源性miR-495的功能和表达,进一步提高iPSC向内皮细胞分化的效率,为心肌梗死的干细胞治疗应用提供更加丰富的血管内皮种子细胞来源。
【作者】梁家亮；
【导师】余细勇；
【作者基本信息】南方医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】诱导多能干细胞内皮细胞分化心肌梗死自杀基因；microRNA；血管新生；

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