乳房假体植入术后表皮葡萄球菌生物膜形成与术后包膜挛缩相关性研究

【摘要】[背景和目的]包膜挛缩(Capsularcontracture,CC))是假体置入乳房重建术后最常见的并发症,表皮葡萄球菌生物膜相关的感染被认为是包膜挛缩重要原因之一。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis,SE)寄居于正常人体皮肤、乳头乳晕、导管内和乳腺腺体等处,是乳房假体植入后发生感染的最主要的条件致病菌。表皮葡萄球菌可通过多种途径随假体植入入侵宿主,如在假体表面发生附着、聚集,进而粘附并形成细菌生物膜,则可导致假体植入后感染的发生。炎症反应的失调会导致大量的炎细胞聚集,刺激纤维母细胞增生,合成胶原纤维,在局部淋巴因子的作用下,巨噬细胞释放生长因子,促进成纤维细胞的增生。成纤维细胞异常增殖,并转化为有收缩功能的肌成纤维细胞,细胞外基质中胶原合成与降解失衡,细胞因子的大量产生,最终由于包膜组织的异常纤维化而导致挛缩。因此,研究乳房假体植入后表皮葡萄球菌生物膜形成与包膜挛缩相关性,对于乳房假体植入后感染及其相关包膜挛缩的防治具有重要的临床意义。本研究的目的：通过体外实验,观察表皮葡萄球菌在硅胶假体表面细菌生物膜形成状况,检测并阐明icaA、icaD、aap基因对假体表面细菌生物膜形成的影响；通过体外表皮葡萄球菌与成纤维细胞共培养,观察表皮葡萄球菌对乳腺成纤维细胞的增殖及表型转变的影响,进一步探讨感染相关包膜挛缩发生的机制；建立假体植入后表葡菌生物膜形成亚临床感染相关包膜挛缩动物模型,揭示细菌生物膜形成与包膜挛缩发生发展密切关系[方法]本研究分为三个部分：1、乳腺外科表皮葡萄球菌icaA、icaD基因及聚集相关蛋白对细菌生物膜形成的影响：收集2011年12月—2013年1月乳腺外科收治的无感染症状女性患者临床标本中分离的44株表皮葡萄球菌。其中26株来自乳腺导管冲洗液细菌培养,11株来自假体及扩张器包膜细菌培养,7株来自乳腺癌术后胸壁引流管细菌培养；种属鉴定为表皮葡萄球菌类型后,行细菌基因组DNA抽提,PCR法检测细菌生物膜形成相关基因icaA、icaD及聚集相关蛋白(aap)基因DNA表达,并根据基因表达结果将其分为icaA+icaD+/aap+组(A组)、icaA+icaD+/aap-组(B组)、icaA-icaD-/aap+组(C组)及icaA-icaD-/aap-组(D组)。取4组菌株制备硅胶材料表面细菌生物膜体外模型,于孵育6、12、24、30、36h采用结晶紫染色法半定量检测表皮葡萄球菌在硅胶材料表面粘附量随着培养时间的变化情况,了解细菌生物膜产生量的变化,绘制生长曲线,；孵育12、24h激光共聚焦显微镜观测形成的生物膜厚度,孵育24h扫描电镜观察细菌生物膜超微结构,了解乳腺外科表葡菌在硅胶表面生物膜的形成能力。2、表皮葡萄球菌对成纤维细胞的增殖及表型转变的影响：(1)、取滇南小耳猪正常乳腺组织行成纤维细胞原代培养,波形蛋白单克隆抗体(Vimitin)免疫组化鉴定；(2)、利用超声裂解仪及反复冻融法制备表皮葡萄球菌裂解液,BCA法测定细菌裂解液蛋白浓度,将含细菌裂解液的条件培养液配置成100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml三个浓度；(3)、MTT法检测普通培养液、含不同浓度表皮葡萄球菌生物膜阳性标准菌株SERP62A、临床分离株SE101裂解液及不同浓度表皮葡萄球菌生物膜阴性标准菌株SEAT12228、临床分离株SE40裂解液的条件培养液对成纤维细胞生长情况的影响；Elisa方法测定普通培养液及含不同浓度表皮葡球菌裂解液的条件培养液培养后细胞上清中的TGF-β1含量；用RT-PCR、Westernblot及免疫组织化学法检测不同培养条件下成纤维细胞的a-SMA的表达。3、乳房假体植入后表皮葡萄球菌生物膜形成与术后包膜挛缩相关性的实验研究：(1)、健康成年雌性滇南小耳猪3头,体重分别35kg、39kg、40kg,乳头5-6对,随机设为A组(对照组)、B组(ATCC12228组)、C组(RP62A组)。(2)、建立小耳猪生物材料(硅胶乳房扩张器)模型。于乳腺腺体下方剥离腔穴,分别于A组分离的腔穴内注入无菌磷酸盐缓冲液1ml,B组及C组分离腔穴内注入新鲜制备的两种实验菌株的细菌悬液lml(1.2×105CFU/ml)表皮葡萄球菌SEATCC12228(生物膜形成阴性株)、表皮葡萄球菌SERP62A(生物膜形成阳性株)后,每只乳房腔穴内植入10ml圆柱形无菌硅胶扩张器1枚,其中A组12枚、B组10枚、C组12枚,共34枚。分别于植入后第二天、第3周、第6周、第9周及第12周抽取前腔静脉静脉血行血细胞分析。(3)、实验动物于清洁环境中饲养3个月后取扩张器周围包膜做检查。用压平式眼压计检测包膜张力,电子天平称量包膜重量,包膜组织学检查：①HE染色后光镜下观察包膜显微结构特点,显微尺测量显微包膜厚度,②Van-Gieson染色后光镜下观察包膜胶原特点,③α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色光镜下观察肌成纤维细胞,④Siriusred苦味酸染色观察Ⅰ型、Ⅲ型胶原分布。⑤扫描电镜观察包膜及硅胶扩张器表面生物膜形成情况,API细菌鉴定系统进行包膜细菌鉴定。[结果]1.分离出44例表皮葡萄球菌临床分离株：①提取DNA经过PCR产物凝胶电泳44株表皮葡萄球菌中,icaA、icaD及aap基因阳性菌株分别为23株(52,27%23/44),23株(52,27%,23/44)及25株(56.81%,25/44)；13株为icaA+icaD+/aap+(A组),12株为icaA+icaD+/aap-(B组),16株为icaA-icaD-/aap+(C组),3株为icaA-icaD-/aap-(D组)；②、44株表皮葡萄球菌中,共29株(65.9%)形成细菌生物膜,其中A组13株,B组7株,C组9株,D组0株；③icaA、icaD及aap基因均与细菌生物膜形成具有相关性(P<0.01),半定量黏附试验示：孵育6h,4组细菌黏附能力比较差异无统计学意义(P>0.05)：12-36h时,A、B、C组黏附能力均显著高于D组,A组显著高于B、C组(P<0.05)；B、C组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。激光共聚焦显微镜观察示,12、24h时A、B、C组细菌生物膜厚度均大于D组,A组明显大于B、C组,比较差异有统计学意义(P<0.05)；B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察,孵育24h时A、B、C组硅胶片表面均可见成熟的细菌生物膜结构,其中A组细菌生物膜分布最广泛、结构最致密、层次最丰富,B、C组细菌生物膜结构相似：D组无明显生物膜形成。2、表皮葡萄球菌对成纤维细胞的增殖及表型转变的影响：①MTT结果提示：表皮葡萄球菌生物膜形成阳性菌株各组(标准株SERP62A及临床分离株SE101)成纤维细胞的吸光值明显高于普通培养液组及不同浓度表皮葡萄球菌生物膜形成阴性菌株各组(标准菌株SEAT12228、临床分离株SE40),P<0.01,且吸光值与细菌裂解液浓度呈正相关；不同浓度表葡菌生物膜形成阴性菌株各组(标准菌株SEAT12228、临床分离株SE40)细胞的吸光值与普通培养液组相比无统计学差异(P>0.05)；②细胞上清中TGF-β1含量检测结果提示,表皮葡萄球菌生物膜形成阳性菌株各组细胞上清中TGF-β1的含量均高于普通培养液组及表皮葡萄球菌生物膜形成阴性菌株各组,P<0.01,与细菌裂解液浓度呈正相关；低浓度的表皮葡萄球菌生物膜形成阴性菌株组细胞上清中TGF-β1含量与普通培养液组无显著差异,P>0.05,随细菌裂解液浓度增加,与普通培养液组相比出现统计学差异,P<0.05；③免疫组化结果表明,表皮葡萄球菌生物膜形成阳性菌株各组的成纤维细胞发生表型转化为a-SMA表达阳性的肌成纤维细胞；表皮葡萄球菌生物膜形成阴性菌株组的细胞也有部分发生表型转化为a-SMA表达阳性的肌成纤维细胞；普通培养液组的细胞不表达a-SMA。④esternblot及RT-PCR检测结果提示,表皮葡萄球菌生物膜形成阳性菌株各组细胞a-SMA蛋白表达水平明显高于普通培养液组及表皮葡萄球菌生物膜形成阴性菌株各组,P<0.01：5组细胞a-SMA蛋白表达水平第5天均有不同程度升高；经细菌刺激的4组细胞第7天能维持与第5天相比较为稳定的表达水平,P>0.05,普通培养液组的细胞第7天a-SMA的蛋白表达水平则发生逆转,与其第5天相比有统计学差异,P<0.01。3、乳房假体表皮葡萄球菌形成与包膜挛缩相关性：3头小耳猪共植入硅胶扩张器34枚,A组包膜挛缩阳性率(GradeⅢ/Ⅳ)16.7%(2/12),B组包膜挛缩阳性率20%(2/10),C组包膜挛缩阳性率66.7%(8/12)。三组包膜结构相似,均可见致密层和疏松层,包膜张力相比无统计学差异,P>0.05,但C组包膜重量、包膜厚度高于A组及B组(P<0.01)。Ⅰ型胶原的面密度对照组及SEAT12228组低于SERP62A组(P<0.05),Ⅲ型胶原的面密度三组无差异(P>0.05)。接种SERP62A菌株与生物膜形成及包膜挛缩的发生密切相关,C组细菌生物膜形成阳性率及包膜挛缩(GradeⅢ/Ⅳ)阳性率均高于A组及B组细菌生物膜形成阳性率及包膜挛缩阳性率,P<0.05；单因素分析结果提示C组接种了细菌生物膜表型阳性表皮葡萄球菌,细菌生物膜形成的危险性分别比A组及B组增加22倍和8倍；同时,C组包膜挛缩GradeⅢ/Ⅳ发生的危险性分别比A组及B组增加7倍和5.6倍；12例细菌生物膜阳性的标本中,10例发生包膜挛,单因素分析结果提示,细菌生物膜的形成可使发生包膜挛缩(GradeⅢ/Ⅳ)增加47.5倍。[结论]1、icaA、icaD基因及aap基因对表皮葡萄球菌在硅胶表面的生物膜形成起到重要作用,其中aap与icaA、icaD同时表达的菌株具有最强的生物膜形成能力。2、表葡菌生物膜阳性菌株能有效促进成纤维细胞的增殖、TGF-β1分泌量增加,能刺激成纤维细胞表达α-SMA,使成纤维细胞转变为肌成纤维细胞；表葡菌生物膜阴性菌株对于成纤维细胞的增殖无明显促进作用,对成纤维细胞转变为肌成纤维细胞有一定作用,但相比表葡菌生物膜阳性菌株作用较弱,表葡菌生物膜阳性菌株比表葡菌生物膜阴性菌株更有利于成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。3、乳房扩张器(假体)植入后,扩张器及(或)其包膜表面表皮葡萄球菌生物膜的形成与包膜挛缩的发生密切相关。
【作者】汤琦；
【导师】黄云超；
【作者基本信息】昆明医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】表皮葡萄球菌；细菌生物膜；icaA；icaD；aap；成纤维细胞；肌成纤维细胞；α-平滑肌肌动蛋白；转化生长因子-β1；包膜挛缩；乳房扩张器(假体)；

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