病毒IL-10通过“MHC-I类分子抗原加工提呈操纵子”致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究

【摘要】[背景和目的]鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma,NPC)是中国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一,其起病隐匿、转移早、治疗后容易复发,五年生存率始终在60%以下。鼻咽癌发病主要与EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)感染、环境(主要为化学致癌物)及遗传等多种因素相关。EBV病毒感染是目前公认的鼻咽癌发生、发展的重要因素之一,其编码蛋白从致瘤、抑制免疫、促进肿瘤转移、抑制肿瘤细胞调亡等方面促进肿瘤的发生。EB病毒的BCRF-1基因片段编码vIL-10与人IL-10有83%的同源性,具有和人IL-10类似的免疫抑制作用,但缺乏免疫调节作用,vIL-10可通过多种途径抑制肿瘤免疫应答,从而促使肿瘤逃逸机体免疫监视。在肿瘤免疫应答过程中,MHC-Ⅰ类分子限制的CD8+细胞毒性T淋巴细胞在阻止肿瘤的发生、发展过程中起关键作用。肿瘤抗原是内源性抗原,首先由低分子量多肽((lowmolecularweightpolypeptide,LMP)-2、7消化.加工成一定分子量的抗原肽,然后与抗原处理相关转运体蛋白(Transporterassociationantigenprocessing,TAP)-1.2结合转运至内质网。在内质网中,MHC(主要是HLA-Ⅰ)结合抗原肽后将其呈递至细胞表面供CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别,从而启动细胞免疫。由于MHC-Ⅰ类基因、TAP基因、LMP基因位置靠近,转录活性同时受干扰素的诱导,能够协调三者基因产物的量,有效提呈抗原,故三者构成的系统被比喻成真核生物MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”。在一系列抗原呈递过程中,无论哪个环节出现异常都会影响肿瘤抗原的提呈,抑制机体对肿瘤的免疫杀伤。因此,明确鼻咽癌中vIL-10是否对MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”表达具有影响以及导致这种影响的机制可以帮助我们更加进一步理解鼻咽癌患者的免疫状态。本文主要目的：通过石蜡切片了解鼻咽癌组织中“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”(即TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ)表达的变化及其与临床因素的关系；通过研究鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA及vIL-10蛋白质的表达,明确vIL-10对鼻咽癌患者免疫细胞的影响；通过体外实验了解vIL-10对鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的影响；阐明vIL-10对NF-κB通路相关蛋白表达影响以及对其下游“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达的影响。[方法]本研究分四部分：1、鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的研究收集昆明医科大学第三附属医院(云南省肿瘤医院)头颈外科住院患者,病理证实为鼻咽低分化鳞癌,同期因鼻咽部肿块至云南省肿瘤医院头颈外科就诊,并行鼻咽部取材病理证实为鼻咽部非特异性炎症为对照组,免疫组织化学法(IHC)检测鼻咽癌石蜡切片中TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ的表达,流式细胞仪(FCM)检测鼻咽癌患者及对照组外周血中CD4+T、CD8+T细胞比例,酶联免疫吸附法(ELISA)检测空腹外周静脉血IL-10含量,并对以上结果进行统计分析。2、鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其对免疫功能影响的研究RT-PCR检测鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA,WesternBlot检测鼻咽癌组织中vIL-10蛋白质；流式细胞术检测鼻咽癌患者外周血CD4+T、CD8+T细胞的比例。3、vIL-10对鼻咽癌细胞“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达影响的研究收集不同时间段vIL-10处理的鼻咽癌细胞,RT-PCR、WesternBolt方法检测vIL-10处理的鼻咽癌细胞中“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”(即TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-I)表达的变化。4、vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响的研究(1)重组质粒pEGFP-N1-TNFα转染鼻咽癌细胞并检测转染后细胞分泌TNF-α的浓度,不同浓度TNF-a作用鼻咽癌细胞,WesternBlot检测不同时间段TNF-a对NF-κB的活性的影响；(2)不同浓度的vIL-10预处理鼻咽癌细胞株2小时后,15ng/mLTNF-α再刺激鼻咽癌细胞,WesternBlot检测NF-κB通路各个蛋白的变化；(3)免疫荧光方法观察vIL-10对NF-κBp65核转位活性的影响；(4)EMSA法检测NF-κBp65在细胞核内的DNA结合活性；(5)CHIP法检测vIL-10对NF-κB目的基因(即MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈“操纵子”)表达的影响。[结果]1、鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的低表达及其与临床因素的关系：①TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ在鼻咽癌组织中表达分别为43.1%、46.55%、41.38%、44.83%、50.00%(25/58、27/58、24/58、26/58、29/58)均低于鼻咽非肿瘤组织中的表达90.00%、95.00%、95.00%、95.00%、95.00%(18/20、19/20、19/20、19/20、19/20)(P<0.05)；②鼻咽癌组CD4+T细胞比例明显低于对照组(33.41±10.04%vs40.15±3.56%,P<0.05),CD8+T细胞比例与对照组比较无统计学差异(25.32±8.29%vs22.89±2.24%,P>0.05),鼻咽癌组IL-10表达明显高于对照组(13.12±1.23vs3.69±1.03ng/ml,P<0.05)；③鼻咽癌中TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ表达与年龄、性别无相关性(P>0.05),与TNM分期、有无淋巴结转移及有无远处转移密切相关(P<0.05)；④CD8+T细胞与TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ表达成正比,IL-10表达与TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ表达成反比,CD4+T细胞与TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ表达无明显相关性；⑤Kaplan-Meier分析提示：临床分期、有无淋巴结转移、有无远处转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达、LMP-2表达、LMP-7表达、HLA-Ⅰ表达与鼻咽癌患者预后相关,具有统计学差异(P<0.05)。多因素Cox回归模型分析：有无远处转移及HLA-Ⅰ表达为鼻咽癌患者独立预后因素(P分别为0.041,0.042)。2、鼻咽癌组织vIL-10的高表达及其与免疫细胞的关系：①34例鼻咽癌组织BCRF-1mRNA呈阳性(34/40,85%),16例鼻咽正常组织BCRF-1mRNA呈阳性(16/20,80%),两者比较无统计学差异(P>0.05)；②30例鼻咽癌组织vIL-10呈阳性(30/40,75%),10例鼻咽正常组织vIL-10呈阳性(10/20,50%),两者比较有统计学差异(P<0.05)；③40例鼻咽癌患者分为vIL-10阳性组和vIL-10阴性组,vIL-10阳性组CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T比值明显低于vIL-10阴性组(24.99±3.88%VS35.92±6.31%,0.86VS1.99,P<0.05),vIL-10阳性组CD8+T细胞也明显低于vIL-10阴性组(20.10±7.68%VS30.61±3.34%,P<0.05)。3、vIL-10抑制鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的表达：(1)mRNA水平上：①CNE-1和CNE-2的TAP-1在不同时间点水平均未表现出显著差异；②vIL-10作用1h、4h、6h、12h时,CNE-1和CNE-2的TAP-2的mRNA均未出现变化,在24h时,TAP-2出现显著下降甚至消失；③LMP-2的mRNA在24h时,CNE-1的LMP-2mRNA出现减弱,CNE-2的LMP-2mRNA甚至消失；④CNE-1细胞在vIL-10作用后1h即出现LMP-7下降,而CNE-2细胞在vIL-10作用后6h出现下降；⑤在24h时CNE-1和CNE-2的HLA-ImRNA水平出现显著下降。(2)蛋白水平上：①CNE-1在vIL-10作用后6h时,TAP-1蛋白水平出现略微下降,12h时并未延续该下降趋势反而有所上升,24h时TAP-1蛋白水平出现显著下降(P<0.05),CNE-2细胞在vIL-10作用后6h、12h时,TAP-1蛋白水平比1h增高,在24h时蛋白水平显著下降(P<0.05)；②CNE-1和CNE-2细胞在vIL-10作用后1h、6h、12h、24h,TAP-2蛋白水平逐渐下降(P值均<0.05)；③vIL-10作用CNE-1细胞后,LMP-2蛋白水平在12h时出现显著下降。CNE-2细胞中则表现为随时间逐渐下降趋势(P值均<0.05)；④CNE-1细胞的LMP-7蛋白在vIL-10作用后12h时出现显著下降。CNE-2细胞中LMP-7蛋白出现随时间逐渐下降趋势(P值均<0.05)；⑤CNE-1和CNE-2细胞在vIL-10作用后,HLA-Ⅰ出现下降趋势,但是在CNE-1细胞中各时间段变化无统计学差异(P>0.05),CNE-2细胞在24h出现显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。4、vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响：(1)vIL-10抑制NF-κ,B通路的活性：①纳米材料介导TNF-α转染鼻咽癌细胞,转染后细胞分泌TNF-α增加,但是未达到实验所需浓度；②TNF-α作用后,CNE-1,CNE-2细胞的NF-κBp-p65表达量均增加,并且并且与TNF-α浓度变化成正比；③CNE-2细胞的IKKa、IKKβ在TNF-α诱导后表达增加,而CNE-1细胞未发现此种变化,两种细胞的p-IKKa/β在TNF-a诱导后表达均增加；④CNE-1、CNE-2细胞的IKBa受到TNF-a刺激后表达减少,并且与TNF-a浓度成反比,两种细胞在TNF-α诱导后p-IKBa表达均增加；⑤CNE-1、CNE-2细胞的p-IKKa/β、NF-κBp-p65的表达与vIL-10浓度呈反比,而IKB蛋白表达与vIL-10浓度呈正比；⑥vIL-10作用CNE-1,CNE-2细胞后,胞浆中NF-kBp65核转位活性减弱。⑦vIL-10可以抑制鼻咽癌细胞中NF-κB的DNA结合活性,在CNE-2中抑制作用呈剂量依赖性。(2)vIL-10抑制NF-κB目的基因“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的表达：ChIP结果显示CNE-2细胞中vIL-10可以通过NF-κB抑制TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ基因表达。[结论]1、鼻咽癌组织中TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ低表达,且与患者免疫抑制相关,HLA-Ⅰ低表达预示鼻咽癌患者不良预后。2、鼻咽癌组织中高表达BCRF-1基因及其蛋白产物vIL-10；vIL-10可以使鼻咽癌患者的免疫细胞发生偏移,发挥免疫抑制。3、vIL-10可明显抑制鼻咽癌MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”的表达,并且呈一定的时间依赖性。4、vIL-10可以抑制NF-κBp65活化、核转位及细胞核内NF-κB与DNA结合活性,进而抑制NF-κB目的基因TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ的转录激活,降低鼻咽癌抗原提呈能力。
【作者】任艳鑫；
【导师】黄云超；李晓江；
【作者基本信息】昆明医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】鼻咽肿瘤；BCRF-1；核因子-κB；病毒白介素-10；抗原提呈；

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