大鼠与Beagle犬肾毒性生物标志物及肠道病毒71型灭活疫苗临床前安全性的研究

【摘要】肾脏是药物代谢和排泄的重要器官,由于其特殊的结构和功能,对药物的毒性作用极具易感性。药物肾毒性已成为临床前药物中止研发和临床不良反应的主要原因。据估计,药物造成的肾损伤占所有急性肾损伤病例中的19-25%。如何及时、准确、快速地评价肾毒性已成为药物研发中的一个重要问题。目前诊断肾损伤最常用的指标为血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN),但由于肾脏强大的代偿作用,在发生轻微损伤时其变化往往不明显,缺乏灵敏度和特异性。因此,为了探求在临床前研究中更为灵敏、可靠的肾毒性早期预测指标,本研究分别采用硫酸庆大霉素建立了Wistar大鼠及Beagle犬的急性肾损伤模型,针对国际组织及临床上最新提出的一系列潜在的肾毒性生物标志物进行了敏感性和特异性的评价,并对大鼠尿液中的microRNA(miRNA)表达谱进行了差异分析,以期找到能够早期预测肾损伤的miRNA标志物。通过对大鼠腹腔注射60和120mg/kg硫酸庆大霉素,每天给药1次,连续给药10天,建立了大鼠肾损伤模型。体重检测结果显示,在连续给药第10天,庆大霉素给药组动物的体重呈现降低趋势,并具有一定剂量相关性；与对照组相比,120mg/kg组动物的肾脏重量自第8天开始持续增加,60mg/kg组动物肾脏重量在给药第11天后也表现增加的趋势,表明了肾脏重量的变化与给药时间及剂量具有一定的相关性。组织病理学分析结果证实随给药剂量及给药时间的增加,庆大霉素给药组动物出现肾小管细胞坏死损伤的动物数增加,且病变程度也随之加重。尿液生物标志物分析结果表明,低、高剂量组动物给药后,尿液中肾损伤分子-1(Kim-1)丛生蛋白(Clusterin)、白蛋白(Albumin)、β2微球蛋白(B2M)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)升高幅度远高于BUN和Cr,个体分析数据也表明这些标志物水平的增长与病理损伤具有较好的对应关系,受试者操作特性曲线(ROC)结果证实这5种标志物的曲线下面积(AUC)均明显高于BUN、Cr,表现出了明显优于BUN和Cr的肾损伤诊断效能,具有更高的灵敏度和特异性,在药物的大鼠临床前安全性研究中具有良好的应用前景。N-乙酰-p-D-葡萄糖苷酶(NAG)、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)和表皮细胞生长因子(EGF)无论Inclusion还是ExclusionROC分析的AUC均高于BUN及Cr,其诊断肾损伤的效能优于BUN及Cr,但不及Kim-1等明显。血管内皮生长因子(VEGF)、酸性糖蛋白(AGP)、碱性磷酸酶(ALP)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(Timp-1)、血管非炎性蛋白-1(Vanin-1)、钙结合蛋白(Calbindin)、乳酸脱氢酶(LDH),这些标志物ROC分析的AUC相当或略低于BUN及Cr,对急性肾损伤诊断有一定诊断效能,但与比BUN与Cr相比无明显优势。白介素18(IL-18)和骨桥蛋白(OPN)未表现出对大鼠急性肾损伤的诊断价值。采用TaqMan(?)ArrayRodentMicroRNACards对第8天对照组和60mg/kg、120mg/kg以及第4天120mg/kg组的动物尿样进行niRNA表达谱分析。通过对比分析第8天60mg/kg和120mg/kg组出现显著变化的miRNA,以及120mg/kg组第4天和8天出现显著变化的miRNA,共发现兼具时间和剂量相关性的32个上调miRNA及14个下调miRNA。以肾小管变性、坏死的组织病理损伤作为诊断的金标准,通过ROC分析初步筛选出上调niR-16-1-3p、345-5p、539、24-3p、466k、99b-3p、489和140-3p以及下调miR-1961、363、367、590-5p、215和451可能作为预测大鼠肾损伤潜在的生物标志物,并且这些miRNA的变化有可能早于组织病理学损伤的出现。但这些niRNA的诊断价值、可能作用的通路及其与肾损伤相关的机制还需要进一步深入研究确认。在应用80mg/kg庆大霉素给药剂量,连续给药9天诱导的Beagle犬急性肾毒性模型上我们评估了尿液NGAL、Clusterin、NAG和尿总蛋白(uTP)的肾毒性诊断性能。结果表明,尿NGAL和Clusterin浓度分别在犬肌肉注射庆大霉素第1和3天后显著升高,表现出明显的时间相关性,且个体动物尿液中NGAL和Clusterin水平变化与其组织病理损伤具有良好的相关性,ROC分析的AUC均为1.000,证实NGAL和Clusterin在犬中诊断早期肾损伤的效能明显优于传统血清标记物BUN和Cr,具有优越的特异性和灵敏度。实时定量PCR结果也表明生物标志物NGAL和Clusterin基因在动物发生肾损伤后表达上调,进一步提供数据支持这两种生物标志物预测肾毒性的特异性。此外,尽管尿NAG水平在动物出现肾损伤后浓度升高幅度不如NGAL和Clusterin,但其活性的升高与给药次数及时间也表现出良好的相关性,具有较高的灵敏度,ROC分析结果也表明其灵敏度和特异性要优于BUN。本研究发现uTP也有一定肾毒性诊断效能,但对急性肾损伤的早期诊断劣于NGAL、Clusterin和NAG,与BUN及Cr相比无明显优势。这些结果为未来尿生物标志物应用于药物的Beagle犬临床前安全性研究奠定了基础。肠道病毒71型(EV71)是一种无包膜的单股正链RNA病毒,是引起婴幼儿手足口病(HFMD)的主要病原体之一。近年来,EV71感染引起的HFMD在多个国家呈周期性暴发,并且不断扩散,已成为全世界,尤其是亚太地区的重要公共卫生问题,对当地的儿童健康造成极大地威胁。由于目前并没有有效治疗EV71感染的抗病毒药物,免疫接种疫苗是预防和控制该病毒传播的最有效方法。因此,为了推动EV71灭活疫苗早日进入人体临床试验,本研究应用Wistar大鼠和食蟹猴两种动物,在临床前系统地评价了EV71疫苗的安全性。研究内容主要包括大鼠肌肉注射EV71灭活疫苗急性毒性研究及大鼠和食蟹猴肌肉注射EV71灭活疫苗的重复给药毒性研究。在大鼠重复给药毒性研究中,动物于0、2、4、6周肌肉注射给予EV71疫苗进行免疫,包括160U/只和320U/只两个剂量,按体重折算,约800U/kg和1600U/kg(大鼠体重按200g计),分别约为临床拟用剂量(320U/人,按儿童平均体重10～20kg计为16～32U/kg)的25～50倍和50～100倍；此外,还增设了单独疫苗佐剂组。在食蟹猴重复给药毒性研究中,动物也同样于0、2、4、6周肌肉注射免疫,分别给予320U/只和1280U/只。按照人份计算,低、高剂量为临床拟用剂量的1和4倍；按照体重折算,低、高剂量分别相当于临床拟用剂量的3.3～6.7倍和13.3～26.8倍。急性毒性研究结果显示大鼠单次肌肉注射大剂量EV71疫苗(640U/只)后,动物耐受性良好,临床症状未见明显异常,体重增长未见影响。给药后15天,大体病理学检查均未见明显异常,表明大鼠单次给药的无明显毒性反应剂量(NOAEL)为640U/只。Wistar大鼠和食蟹猴重复给药毒性研究证实重复肌肉注射EV71疫苗后,在这两种种属动物中,除检测发现血液中性粒细胞或单核细胞数量及比例在背景范围内的轻微变化以外,并没有观察到明显的与注射EV71疫苗相关的系统性毒性反应,血清中也未检出抗核抗体。组织病理学检查结果发现给予EV71疫苗的大鼠和食蟹猴的注射部位均出现了轻至重度的肌纤维变性、炎性细胞浸润、肉芽肿等炎症相关的病理学改变,这些病变随时间延长逐渐减轻。此外,大鼠重复给药毒性试验中设置的铝佐剂对照组动物,也发现类似的组织病理学改变。这些结果表明上述组织病理变化与反复肌肉注射含有铝佐剂疫苗引起的机械性损伤和炎症刺激有关。此外,血清中和抗体检测结果显示大鼠和食蟹猴在接受第二次EV71疫苗接种后,动物血清的中和抗体均达到阳转水平,表明在本研究供试品EV71灭活疫苗具有良好的免疫原性。总之,通过在Wistar大鼠和食蟹猴两种动物种属中系统的评价EV71灭活疫苗的安全性,证实了该EV71疫苗具有良好耐受性,未发现明显的毒性反应,可诱导产生特异的中和抗体反应,这些结果支持该产品可进入下一阶段—Ⅰ期临床试验。同时这些研究数据也将有助于EV71灭活疫苗在临床试验阶段中剂量水平的确定以及免疫接种策略的制定。
【作者】周晓冰；
【导师】李波；
【作者基本信息】北京协和医学院，药理学，2014，博士
【关键词】生物标志物；肾毒性；尿；大鼠；比格犬；手足口病；肠道病毒71型灭活疫苗；临床前安全性评价；食蟹猴；

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