通过抑制微炎症，干预糖尿病肾病的分子机制初探

【摘要】研究背景：糖尿病肾病是糖尿病的并发症之一,治疗手段有限,亟待拓展。越来越多的研究表明肾脏局部慢性炎症是糖尿病肾病发生、发展的重要因素,但其分子机制还未明确。有研究提示炎症小体(NLRP3)、microRNA等炎症相关因素可能在多个层面影响着糖尿病肾病炎症状态的发生,作为胰岛素抵抗的推手,促进糖尿病肾病的发生。我们前期实验已表明倍半萜内酯(PTN)可缓解db/db小鼠模型糖尿病肾病临床和病理,降低MCP-1、IL-6等炎症因子表达及改善局部胰岛素抵抗状态。本文旨在探讨糖尿病肾病患者及db/db鼠DKD模型肾脏局部是否存在微炎症状态,探究PTN如何从基因层面、蛋白水平,通过直接抑制NF-κB、NLRP3,抑制肾脏局部的慢性炎症发生,延缓糖尿病肾病进展提供理论依据。研究目的：了解糖尿病肾病患者肾脏局部炎症状态,观察巨噬细胞浸润、炎症小体(NLRP3)、NF-κB在肾脏表达变化。利用db/db小鼠模型研究糖尿病肾病中NLRP3、NF-κB通路及microRNA谱变化情况,探究PTN对肾脏局部微炎症的影响,延缓糖尿病肾病的可能机制。研究方法：(1)筛选2011年1月至2014年1月北京协和医院肾内科住院经肾穿刺病理活检确认为糖尿病肾病的患者37例,其中7例糖尿病病史短,病理仅有肾小球肥大,记为DKD1组,其余记为DKD2组。收集同期微小病变(CTL1)10例及膜性肾病患者(CTL2)15例与DKD组进行比较。通过免疫组织化学方法,检测CD68、NF-κB、炎症小体(NLRP3)表达情况以确认有无慢性炎症现象。(2)利用前期动物模型,分别取实验小鼠三组[对照组(db/m+NS)、糖尿病组(db/db+NS)、PTN干预组(db/db+PTN)],T0(8周龄)、T4(12周龄)及T8(16周龄)留取肾脏标本。利用T8肾脏组织进行深度测序,查看db/db小鼠microRNA表达谱变化及PTN对其影响,并对于差异表达最大的microRNA146a-5p给与实时定量PCR验证。(3)利用实时定量PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学方法、免疫酶联吸附法验证IRAK1蛋白、TRAF6蛋白、IKB蛋白、NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1的表达情况,初步探讨PTN干预小鼠糖尿病肾病可能的机制。研究结果：糖尿病肾病早期的患者肾脏局部与对照组相比,可见肥大的肾小球中、肾间质、肾小管局部CD68阳性,OD值为(6.9±6.7)‰,与对照组相比,差异具有统计学意义,P<0.05；而糖尿病中晚期患者肾小球、肾小管、肾间质存在大量片状分布的CD68阳性胞浆,OD值(16.7±7.9)‰,与对照组(CTL1、CTL2)、糖尿病初期组比较,差异具有显著性统计学意义,P<0.01。与CD68结果一致,NLRP3及NF-κB表达也随着糖尿病肾病病情而加重。NF-κB在DKD1期组、DKD2组OD值分别(5.4±1.8)%、(12.7±8.0)%,分别与CTL1或CTL2组比较,差异具有统计学意义,P<0.05。NLRP3在DKD1组、DKD2组OD值分别(15.8±7.7)%、(18.6±7.7)%,DKD2组与对照组(CTL1、CTL2)及DKD1组比较,差异具有统计学意义,P<0.05。在动物实验中,糖尿病肾病组(db/db+NS)与对照组(db/m+NS)相比,表达上调及下调的microRNA数目分别为206个和91个,糖尿病肾病组(db/db+NS)与干预组(db/db+PTN)相比表达上调及下调的microRNA分别为101个和76个。在一定表达量的前提下,同时满足在糖尿病肾病组(db/db+NS)下调而干预组(db/db+PTN)中上升的microRNA有68个,前5位依次为：microRNA146a-5p、microRNA223-3p、microRNA16-5p、microRNA126-3p、microRNA195-5p。在一定表达量的前提下,同时满足在糖尿病组上调而干预组中下调的microRNA共72个,其中前5位的依次为：microRNA204-5p、microRNA7d-3p、microRNA2137、microRNA5115、microRNA193b-3p。它们与炎症、肿瘤、血管生成等密切相关。microRNA146a-5p在db/db模型小鼠中表达量降低最显著,且干预组中能够恢复最明显,对其进行实时定量PCR功能验证。发现糖尿病肾病组(db/db+NS)与同周龄的对照组(db/m+NS)相比,microRNA146a-5p表达量降低,且随周龄增加而表达量减少,糖尿病肾病组(db/db+NS)vs对照组(db/m+NS)△CT值分别为：T0：0.62±0.43vs0.82±0.44；T4：0.42±0.38vs0.92±0.64；T8：0.34±0.12vs0.86±0.68,T8具有统计学意义。干预组(db/db+PTN)与同周龄糖尿病肾病组(db/db+NS)相比表达量增多,db/db+PTN组vsdb/db+NS组的△CT值分别为：TO：0.69±±0.42vs0.62±0.43；T4：1.07±0.96vs0.42±±0.38；T8：0.72±0.53vs0.34±0.12,无统计学差异,但T4及T8组microRNA146a-5P表达量均较糖尿病组升高一倍以上。在对照组(db/m+NST0、T4、T8)中,小鼠的IRAK1mRNA、TRAF6mRNA、IRAKl蛋白、TRAF6蛋白、pho-IκB蛋白表达量均处于同一较低水平。糖尿病组(db/db+NS)与对照组(与db/m+NS)相比,表达量升高,且随着周龄增加而表达量升高,差异有统计学意义。而干预组(与db/db+PTN)和糖尿病组((ib/db+NS)相比,各蛋白表达量下降。IκB作为NF-κB抑制蛋白,在IκB免疫组织化学染色中可见对照组(db/m+NSTO)、糖尿病组(db/db+NSTO)及干预组(db/db+PTNTO)有IκB在肾小管稳定表达,而随着db/db小鼠周龄的增加,db/db小鼠IκB逐渐消失,而PTN干预后IκB在肾小管逐渐表达。NF-κB与之相反,在对照组(db/m+NSTO、T4、T8)、糖尿病组(db/db+NSTO)有NF-κB在肾小管少量表达,而随着周龄增加,db/db+NS组小鼠NF-κB表达逐渐升高,主要在肾小管、肾间质区域。差异具有统计学意义。经PTN干预后,阳性区域减少,差异具有统计学意义。对照组(db/m+NSTO)、糖尿病组(db/db+NSTO)、干预组(与db/db+PTNTO)小鼠的NLRP3mRNA及WesternBloting表达量处于较低水平,差异无统计学意义。在基因表达层面及蛋白质层面均证实db/db+NS随周龄增长,NLRP3表达增加,T4及T8的mRNAΔΔCT糖尿病组(db/db+NS)vs对照组(db/m+NS)为：T40.82±0.52vs0.43±0.36;T81.29±0.35vs0.66±0.22。经PTN干预NLRP3表达量下降,mRNAΔΔCT干预组(db/db+PTN)vs糖尿病组(db/db+NS)为：T40.53±0.21vs0.82±0.52；T8：0.71±0.26vs1.29±0.35,后者差异具有统计学意义,P<0.01。Caspase-1蛋白表达结果与NLRP3一致,其中对照组(db/m+NST0)、糖尿病组((Ib/db+NSTO)、干预组(与db/db+PTNTO)小鼠Caspase-1蛋白表达量处于较低水平。糖尿病组比对照组表达升高,△△CT值为T4：1.50±0.19vs1.13±±0.24；T8::1.33±±0.25vs1.02±0.21,具有统计学差异。而PTN干预下可见Caspase-1蛋白表达降低,db/db+PTN组vsdb/db+NS组无△△CT为：T41.19±0.39vs1.50±0.19,T80.75±0.05vs1.33±0.25,后者差异有统计学意义。IL-1mRNA表达上,db/db+NS同样表现出随周龄升高,而表达增高的特点,但在干预组(db/db+PTNT8)mRNA表达未降低,其△△CT为2.82±0.06。而在IL-1WB与ELISA结果一致。随着周龄增加,db/db+NS组IL-1表达量逐渐升高,而PTN干预后,水平降低趋势。研究结论：在糖尿病肾病的患者及db/db小鼠糖尿病肾病模型中均存在肾脏局部慢性炎症状态。db/db小鼠糖尿病肾病模型中有NF-κB通路及NLRP3通路各蛋白表达的增加。db/db小鼠糖尿病肾病模型存在microRNA谱的变化,尤其是nmicroRNA146a-5p表达下调。在糖尿病肾病的发生、发展过程中,microRNA146a-5p被抑制,NF-κB通路及NLRP3通路被激活,可能是重要的组成部分。PTN干预后,促进microRNA146a-5p表达、同时抑制NF-κB、NLRP3表达,进一步起到抑制糖尿病肾病局部炎症,延缓疾病进展的。
【作者】史晓虎；
【导师】李学旺；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】糖尿病肾病；倍半萜内酯；microRNA146a；巨噬细胞；核转录因子KappaB；炎症小体；NLRP3；

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