低氧预处理人脐带间充质干细胞治疗急性心肌梗死的实验研究

【摘要】目的：本课题在体外收集脐带,分离、培养、扩增、鉴定人脐带间充质干细胞(]humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUC-MSCs),将hUC-MSCs进行不同浓度低氧预处理,观察抗凋亡能力和分泌细胞因子能力的变化。选取中华小型猪建立急性心肌梗死模型,将低氧预处理hUC-MSCs和未处理hUC-MSCs经心外膜移植到心肌梗死组织周围,比较两者在心肌组织修复中作用有无差别,并进一步探讨可能存在的机制。方法：无菌条件下采集足月剖腹产胎儿脐带,经体外分离、培养、扩增hUC-MSCs至第六代,进行鉴定。按照预处理氧浓度不同分为1%02组,3%O2组,5%02组,10%02组和对照组(21%02组),各组hUC-MSCs在设定氧浓度条件下预处理24小时。通过实时定量PCR、ELISA、AnnexinV-FITC/PI等方法比较各组细胞抗凋亡能力和细胞因子分泌能力不同,选取结果最佳的组进行动物实验。选取中华小型猪,全麻下经正中切口入胸,结扎冠状动脉左前降支远端1/3处,制作急性心梗模型。将实验动物随机分3组(6只／组)：对照组(Control)在心梗局部注射生理盐水,正常培养hUC-MSCs组(Nor)注射未处理hUC-MSCs,低氧预处理组(Hyp)注射低氧预处理hUC-MSCs。细胞注射量为2.5×107/只,分10到15个点注射。术后即刻、术后6周行超声心动图,静息核素心肌灌注显像检查。6周后人道处死动物,采集心脏标本,用Masson三染色、免疫荧光染色和TUNEL染色观察移植干细胞在体内定植、生存、血管新生及细胞凋亡情况。结果：(1)hUC-MSCs表面分子表型CD73、D90、CD105阳性表达,CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR阴性表达。实时定量PCR示促凋亡基因Bax在1%02组、3%02组表达量均显著低于对照组(21%02组)和10%02组(p<0.01),其余各组间比较无统计学差异。抗凋亡基因Bcl-2在所有低氧预处理组表达量均显著高于对照组(p<0.01)；在1%02组表达量显著低于3%02组(p<0.01),在1%02组表达量低于5%02组,有统计学意义(p<0.05),其余各组间比较无统计学差异。凋亡诱导实验后,AnnexinV/PI检测示所有低氧预处理组hUC-MSCs与阳性对照组(21%02组)相比,早期、晚期及总凋亡数量均显著减少(p<0.01)。1%02组和3%02组hUC-MSCs早期凋亡低于10%02组,有统计学意义(p<0.05),其余各组之间无统计学差异。(2)实时定量PCR示HGF基因在1%02组、3%02组和5%02组表达量均显著高于对照组(21%02组)(p<0.01)；在1%02组和3%02组表达量显著高于10%02组(p<0.01)；VEGF在3%02组表达量较高,但与对照组比较无统计学差异；KGF在3%O2组和5%02组表达量均显著高于对照组、10%02组以及1%02组(p<0.01)；NGF在3%02组和5%02组表达量均显著高于对照组(p<0.01),在3%02组表达量高于10%02组和1%02组,有统计学差异(P<0.05),在5%02组表达量著高于10%02组(p<0.01)。ELISA检测示：HGF分泌量在1%02、3%02组均显著高于对照组和10%02组(p<0.01)。VEGF分泌量在3%02组高于对照组和10%02组,有统计学意义(p<0.05)。KGF分泌量在3%02组和5%02组均显著高于1%02组和对照组(p<0.01)。NGF分泌量在3%02组和5%02组均高于对照组,有统计学意义(p<0.05)。(3)干细胞移植6周后,超声心动图示低氧预处理组LVEDV低于对照组P<0.05,各组术后6周与术后即刻LVEF的差值比较,低氧预处理组高于对照组,P<0.05。术后6周,低氧预处理组和正常氧干细胞移植组△WT%均显著高于对照组(P<0.01),低氧预处理组高于正常氧干细胞移植组,有统计学意义(P<0.05)。静息放射核素显像示灌注质量缺损百分率(]massdefectpercent,MDP)的差值即△MDP比较,两干细胞治疗组显著低于对照组(P<0.01)。各组术后6周与术后即刻LVEF的差值比较,低氧预处理组高于对照组,有统计学意义(P<0.05)。Masson三染色示低氧预处理组纤维组织面积小于正常氧细胞组,后者小于对照组,有统计学意义(Hyp：37.14±1.78%,Nor:41.41±0.58%,Control:47.20±3.07%,P<0.05)。低氧预处理组与对照组相比纤维组织面积显著减少(P<0.01)。(4)免疫荧光测定显示：在低氧预处理组存活的hUC-MSCs即人p2微球蛋白阳性细胞(Hyp:39.0±7.6cells/hpf,Nor:18.7±5.7cells/hpf,)明显多于正常氧培养组,有统计学意义(P<0.05)。TUNEL染色法示两干细胞治疗组凋亡细胞均显著少于对照组(Hyp:10.0±2.6cells/hpf,Nor:49.0±6.6cells/hpf,Control:87.0±9.0cells/hpf,P<0.01),低氧预处理组凋亡细胞显著少于正常氧培养组(P<0.01)。低氧预处理组IsolactinB4阳性累计光密度值(integratedopticaldensity,IOD)显著多于正常氧培养组和对照组(Hyp:517856.7±43670.5pixels/hpf,Nor:238294.7±66840.0pixels/hpf,Control:137114.0±15168.7pixels/hpf,P<0.01),正常氧培养组IsolactinB4阳性IOD多于对照组,有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)3%低氧预处理能提高hUC-MSCs抗凋亡能力和分泌细胞因子的能力。(2)移植低氧预处理hUC-MSCs能在一定程度上改善心肌梗死后心脏功能的恢复。(3)低氧预处理hUC-MSCs在移植局部有更强的生存能力,能减少心梗局部瘢痕面积,减少纤维化。能通过旁分泌作用促进血管新生,减少心肌细胞凋亡。
【作者】裴宇；
【导师】刘晓程；
【作者基本信息】北京协和医学院，外科学，2014，博士
【关键词】脐带间充质干细胞；低氧；急性心肌梗死；细胞因子；凋亡；

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