MicroRNA在胚胎干细胞分化过程中作用机制研究

【摘要】胚胎干细胞(EmbryonicStemCell,简称ES细胞)具有的自我更新、多潜能性等特性,使其具有广泛的应用价值。ES细胞状态的维持受相关信号转导通路和转录因子的调控,现已知在小鼠ES细胞中,最重要的信号转导通路是LIF/STAT3、BMP4和WNT通路；Oct4、Sox2和Nanog是小鼠ES细胞维持自我更新的三个核心因子。MicroRNA是一类长度～22nt的非编码RNA,在转录后水平调节多种基因的表达,现已证明其在生命过程的各个方面行使功能。MicroRNA对ES细胞状态的维持也发挥着重要调控作用,现已知多种microRNA影响ES细胞的自我更新和分化潜能；对成熟microRNA生成具有关键作用的dgcr8被敲除的ES细胞表现出分化功能缺陷：在成体细胞重编程过程中引入或者抑制某种microRNA的表达能提高iPS细胞的形成效率。目前对以ESCC(EScell-specificcellcycle)类microRNA为代表的促进ES细胞自我更新的nicroRNA的研究较为广泛,而对于促进ES细胞分化的microRNA研究相对较少,因此我们拟系统性地筛选能够促进ES细胞分化的rnicroRNA,并研究其在调控ES细胞自我更新及分化过程中的作用,并对这些nicroRNA促进ES细胞分化的内在分子机制进行阐述。首先我们对microRNA在ES细胞和已分化细胞中的表达谱,以及靶向ES细胞自我更新维持重要转录因子(Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-myc、Rex1、Sall4、Stella和Lin28)的microRNA进行整体评估,筛选出40个可能促进ES细胞分化的候选microRNA;随后我们在无内源性nicroRNA表达的dgcr8-/-ES细胞中对这些候选microRNA进行功能验证,主要包括克隆形成实验、碱性磷酸酶染色、Oct4免疫荧光、细胞周期、ES细胞正常培养条件下基因表达谱变化等实验,我们将实验结果进行综合评估,得到以let-7c、miR-129、miR-9、miR-124、miR-24为代表的15个在dgcr8-/-ES细胞中表现出显著抑制ES细胞自我更新和促分化能力的microRNA,其中let-7c、miR-300、miR-24、miR-27a、miR-124、miR-27b和miR-129在有内源microRNA表达的野生型ES细胞中也表现出一定促分化的能力。进而,我们对产生于同一个基因簇位置上的miR-27a和miR-24进行进一步的功能研究和机制探讨。实验结果显示：miR-27a和miR-24在分化细胞和组织中高表达,过表达miR-27a和miR-24能显著抑制dgcr8/-ES细胞的自我更新,并促进ES细胞向各胚层不同程度分化；该基因簇受c-myc的负调控,分化过程中c-myc的下降会诱导miR-27a和miR-24的表达上升；miR-27a和miR-24靶向ES细胞重要转录因子和信号转导分子Oct4、Foxol、gp130、Smad3和Smad4,ES细胞在分化过程中这些因子的表达下降进而导致c-myc的低表达,促使miR-27a和miR-24的表达进一步提高,从而在分化过程中形成了一个负馈调节通路,促使ES细胞不断走向分化。此外,我们发现在Oct4、Sox2、Klf4三因子诱导重编程的条件下同时抑制miR-27a或miR-24的表达能显著提高iPS细胞形成效率,且诱导出的诱导多能干细胞具有全能型。在该研究中,我们对促ES细胞分化的microRNA进行了一次全面功能性的筛选,发现多个明显促进ES细胞分化的microRNA,并对其中表现显著的miR-27a和miR-24进行了深入的功能和分子机制研究,阐明了在ES细胞分化过程中microRNA调控的可能机制,这对于ES细胞的分化研究有着重要的参考价值。
【作者】姚南；
【导师】黄粤；
【作者基本信息】北京协和医学院，遗传学，2014，博士
【关键词】胚胎干细胞；微小RNA；自我更新；多潜能性；分化；重编程；

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