hsa-miR-483-3p在胰腺导管腺癌中表达及功能的初步研究及对肾上腺皮质肿瘤诊断和预后的意义研究

【摘要】一.miR-483-3p在胰腺导管腺癌中的表达及功能的初步研究[背景]MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA,通过转录后翻译抑制或靶mRNA裂解参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。人类基因组中已鉴定出超过1000个miRNA,均为组织特异性表达。差异表达的miRNA可起到癌基因或抑癌基因的作用。研究发现,miR-483-3p与多种人类肿瘤的形成关系极为密切,且miR-483-3p在不同肿瘤中的表达也存在组织特异性,在有些肿瘤中表达异常升高,而在有些肿瘤中异常低表达,在不同肿瘤中所起的作用也不完全相同,甚至作用相反。如在胃癌等高表达的癌中发挥癌基因的作用,而在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因的作用等。本研究的目的是阐明miR-483-3p在侵袭性的胰腺导管腺癌及非侵袭性的癌前病变的表达情况及其与临床病理特征和预后的关系,并进一步探索其在胰腺导管腺癌发生发展中所起的作用。[方法]1.利用锁定核酸-原位杂交技术(LNA-ISH)在组织芯片(63例胰腺导管腺癌和10例正常胰腺组织)中检测miR-483-3p的表达和定位情况。2.在另外117例胰腺导管腺癌患者[男性65例(58.8%),女性51例(41.2%)；年龄<65岁77例(65.8%),≥65岁40例(34.2%)]手术切除的石蜡组织包埋切片中(每例对应胰腺癌旁非肿瘤组织)验证miR-483-3p的表达情况,并分析miR-483-3p表达与胰腺导管腺癌临床病理特征的关系。并且对117例胰腺癌患者进行随访,对其中94例获得完整随访资料患者进行生存分析。采用log-rank法对miR-483-3p高表达组和低表达组做K-M曲线,比较二者总体生存时间差异。并分别用单因素和多因素Cox风险比例回归模型对各临床病理因素和miR-483-3p表达进行生存分析。3.进一步探索miR-483-3p在胰腺非侵袭性病变,如胰腺上皮内瘤变(PanlNs)中的表达情况。观察117例胰腺癌患者癌旁的39例PanlNl,27例PanIN2和16例PanIN3,并另外选取了11例慢性胰腺炎(CPs)组织标本,对其进行miR-483-3p表达情况检测,明确其是否是胰腺癌发生的早期事件。4.为进一步探究miR-483-3p在胰腺导管腺癌发生中所起的作用,我们选取了PANC-1和MIAPaCa-2两株高表达miR-483-3p的胰腺癌细胞系,转染miR-483-3pinhibitor,分别用CCK-8检测,Edu检测,和软琼脂克隆形成实验,PI单染,PI/FITC双染实验观察抑制miR-483-3p表达后对胰腺癌细胞生长,增殖,集落形成能力,及对周期和凋亡的影响,并在裸鼠体内进行皮下MIAPaCa-2细胞移植瘤种植,注射miR-483-3pantagomir,观察对体内肿瘤生长的影响。[结果]1.组织芯片检测结果显示miR-483-3p在61例(96.8%)胰腺导管腺癌组织中阳性表达,在正常胰腺组织的腺泡组织中阳性表达,但在正常的胰腺导管组织中阴性表达。2.进一步在另外117例胰腺导管腺癌中的验证检测发现,117例胰腺癌组织中,100%呈miR-483-3p阳性表达,其中强阳性表达的有65例(55.6%)。正常胰腺腺泡中全部呈强阳性表达,但在正常的胰腺导管组织中仅有13.7%(16/117)呈弱阳性表达,其余全部阴性。分析miR-483-3p与胰腺导管腺癌临床病理特征的关系,发现miR-483-3p表达与肿瘤的组织学分化级别相关(p<0.05)。高分化癌中miR-483-3p强阳性表达率为81.3%(26/32),中分化癌中为75.5%(37/49),低分化癌中为33.3%(12/36).MiR-483-3p表达与肿瘤分化级别呈负相关关系。对miR-483-3p表达与预后的关系进行log-rank分析,作Kaplan-Meier曲线,可以看到miR-483-3p高表达组比miR-483-3p低表达组的生存时间明显要短,miR-483-3p高表达组的中位生存期为22.0±4.2月,而miR-483-3p低表达组的中位生存期为34.0±9.3月(p=0.040)。用单因素Cox回归模型对各临床病理特征及miR-483-3p表达作预后分析,发现miR-483-3p高表达与较差的预后相关(HR=1.807；95%CI=1.012-3.227；p=0.045)。多因素Cox风险比例回归模型分析发现,miR-483-3p高表达是提示患者预后较差的独立预后因素(HR=2.584;95%CI=1.268-5.264；p=0.009)。3.胰腺上皮内瘤变(PanIN)是胰腺导管腺癌(PDAC)最常见的非侵袭性前体病变。在PanIN中检测miR-483-3p的表达情况,39例PanIN-1,19例(48.7%)弱阳性(+),20例(51.3%)阴性(一)；27例PanIN-2中,4例(14.8%)强阳性(2+),23例(85.2%)弱阳性(+)；16例PanIN-3中,14例(87.5%)强阳性(2+),2例(12.5%)弱阳性(+)。从PanIN-1到PanIN-3,miR-483-3p强阳性率分别为0/39(0%),4/27(14.8%)和14／16(87.5%)。可见,从PanIN-1到PanIN-3,miR-483-3p的表达量是随组织分化级别的升高而升高的(p<0.001)。在11例慢性胰腺炎中,仅有6例(54.5%)弱阳性表达miR-483-3p,其余全部阴性,未发现强阳性表达病例。综合以上结果表明,MiR-483-3p表达异常发生在胰腺导管腺癌发生发展的早期阶段。4.体外抑制miR-483-3p的表达能影响胰腺癌细胞的生长,增殖,周期,凋亡。体内瘤内多点注射miR-483-3pantagomir裸鼠移植瘤模型结果发现,注射miR-483-3pantagomir后肿瘤的生长速度显著降低,与注射controlantagomir的对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。[结论]miR-483-3p异常表达发生在胰腺导管腺癌的早期阶段；在胰腺导管腺癌中miR-483-3p的表达与组织学分化相关,并且其高表达提示较差的预后；体外和体内抑制miR-483-3p的表达能抑制胰腺癌细胞的生长,因此miR-483-3p可能成为胰腺导管腺癌潜在的治疗靶点。二.miR-483-3p对肾上腺皮质肿瘤诊断和预后的意义研究[背景]肾上腺皮质癌和腺瘤的治疗和预后有极大差别,但是二者的鉴别诊断却很困难。本研究的目的是寻找鉴别肾上腺皮质癌(ACC)和腺瘤(ACA)相关的临床病理指标和分子标志物。[方法]样本来源于2001年7月至2012年7月北京协和医院经手术切除的肾上腺肿瘤标本。其中具有完整的临床、病理资料的肾上腺皮质癌存档石蜡标本共25例作为实验组；肾上腺皮质腺瘤1564例,从中随机选取25例作为对照组。对这50例肾上腺皮质肿瘤的临床资料进行回顾性分析,采用WEISS系统进行组织形态学评分,并进行随访。用锁定核酸原位杂交技术(LAN-ISH)检测miR-483-3p的表达,用免疫组化的方法(IHC)检测IGF2和Smad4的表达情况,并分别分析miR-483-3p表达与IGF2或Smad4表达之间的关系。分别分析这三个指标与临床病理特征的关系。进一步检测细胞增殖指数MIB-1在肾上腺皮质癌和腺瘤中的表达情况,并分析上面三个指标与细胞增殖指数MIB-1之间的联系。在选取的15例交界性肿瘤(WEISS得分=2或3)中检测这四个指标的表达情况,并进行随访,根据随访结果检测各指标的诊断效能。[结果]临床资料回顾性分析和WEISS系统评估结果发现：肿瘤的大小,重量,内分泌功能和Weiss系统都是鉴别良恶性肾上腺皮质肿瘤的有效指标(p<0.001)。MiR-483-3p在68%(17/25)肾上腺皮质癌(ACC)中过表达,而仅在12%(3/25)肾上腺皮质腺瘤(ACA)中过表达(p<0.05)。而且,通过分析miR-483-3p表达与IGF2和Smad4蛋白表达的关系,发现miR-483-3p表达与IGF2蛋白表达正相关(p<0.05),但与Smad4蛋白表达无统计学联系(p>0.05)。联合应用miR-483-3p和Smad4蛋白表达两个指标可提高肾上腺皮质癌的诊断准确性。而且,Smad4蛋白过表达是提示好的疾病结果的预后指标。MIB-1在64%(16/25)ACCs中高表达,仅在4%(l/25)ACAs中高表达。然而,MIB-1表达与miR-483-3p,IGF2或Smad4表达无统计学相关性。通过进一步在15例交界性肿瘤中检测这四个指标,确认了联合应用miR-483-3p和Smad4蛋白表达这两个指标可以辅助WEISS评分更好的从组织学较难判定的交界性肿瘤中鉴别出肾上腺皮质癌。[结论]肿瘤大小,重量,内分泌功能和Weiss系统是准确鉴别诊断大多数肾上腺皮质癌与腺瘤的临床病理指标。而在组织学上较难鉴别的交界性肿瘤,miR-483-3p和Smad4的联合应用可用来辅助鉴别诊断肾上腺皮质癌。
【作者】王翠萍；
【导师】陈杰；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】miR-483-3p；锁定核酸原位杂交(LNA-ISH)；组织芯片；胰腺导；管腺癌(PDAC)；胰腺上皮内瘤变(PanIN)；慢性胰腺炎(CP)；分化；预后；肾上腺皮质肿瘤；临床病理特征；诊断；锁定核酸原位杂交；

【参考文献】
[1]李洋,邸婧,郑华均.有序介孔分子筛SBA-15/MCM-41在电催化方面的应用[J].浙江化工,2014,10:34-38.
[2]景娜娜.汉语难易结构的特点及生成研究[D].广东外语外贸大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[3]郑金荣.天津市医学重点学科信息保障系统[J].医学情报工作,2005,05:334-335.
[4]李宁.外资并购监管法律研究[D].北方工业大学,经济法学,2004,硕士.
[5]高虎.新疆精河艾木斯呆依—可克萨拉铁铜矿床地球化学特征及成因探讨[D].中国地质大学（北京）,矿物学、岩石学、矿床学,2014,硕士.
[6]邝宁华.知识型企业的管理模式和团队间知识共享研究[D].西安电子科技大学,企业管理,2004,硕士.
[7]赵欣欣.中国城乡居民收入差距的统计分析与研究[D].东北财经大学,统计学,2003,硕士.
[8]陈澎.人口年龄结构对住宅需求的影响分析[D].南京大学,人口、资源与环境经济学,2013,硕士.
[9]朱磊.蟹寄江氏伪钟虫防治药物的筛选及其对几种淡水生物的毒性作用[D].上海海洋大学,临床兽医学,2013,硕士.
[10]纪志鹏.基于云GIS的物流配送路径研究[D].中国矿业大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[11]杨英.反义寡核苷酸联合用药的抗肿瘤研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,生物化学与分子生物学,2004,硕士.
[12]仝晓辉.轨道车辆车体顶端板拉延成形工艺模拟研究[D].吉林大学,材料加工工程,2014,硕士.
[13]程启明.锤熔烧结模糊控制系统[J].冶金自动化,1996,03:43-45.
[14]薛慧.不同眼轴长度患者白内障超声乳化术后黄斑厚度变化的临床观察[D].大连医科大学,眼科学,2012,硕士.
[15]杨宇.风力发电机风轮模拟及系统研究[D].内蒙古科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[16]于文雯.镍钛—不锈钢激光焊复合弓丝细胞毒性的检测[D].吉林大学,口腔医学（专业学位）,2014,硕士.
[17]陈爽爽.基于Gradient Boosting算法的癫痫检测[D].山东大学,电路与系统,2013,硕士.
[18]杨阳.蝴蝶兰种质资源的综合评价[D].南京农业大学,园林植物与观赏园艺,2012,硕士.
[19]姜俊云.ε-聚赖氨酸生产菌株的选育与发酵工艺的研究[D].天津科技大学,发酵工程,2004,硕士.
[20]刘晓靖.京沪高铁沧州段WCDMA无线网络优化[D].天津大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[21]刘海潮.肝癌患者外周血及癌组织中细丝蛋白A表达水平的研究[D].郑州大学,普通外科学,2013,硕士.
[22]董亚岭.涡轮增压器传动轴摩擦焊界面特征与质量控制[D].重庆大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[23]吴坤.基于工作流的企业办公自动化系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[24]金巍巍,张人超,牟一平,徐晓武,周育成,严加费,张苗尊.腹腔镜胰头十二指肠切除术手术流程优化[J].中华肝脏外科手术学电子杂志,2014,06:338-340.
[25]史文超.N公司文档管理系统方案选择[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[26]王玉洁.家长式领导对“80后”员工组织承诺的影响研究[D].东北师范大学,企业管理,2012,硕士.
[27]孟斌.人工合成细交链孢菌酮酸的除草生物活性评价[D].南京农业大学,植物学,2013,硕士.
[28]张敏.卒中患者急性期的抑郁筛查及与卒中后抑郁相关因素的研究[D].华中科技大学,神经病学,2013,硕士.
[29]陈坚,高飞.电力设备生命周期管理[J].电力信息化,2005,05:38-40.
[30]李苗苗.外源钙对不同生态型沙地云杉（Picea mongolica）幼苗抗旱性影响的研究[D].华东师范大学,生态学,2013,硕士.
[31]徐楠.大规模侵权案件适用惩罚性赔偿研究[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[32]李思默.女性主义视域下王蕙玲影视作品的女性形象研究[D].西北大学,戏剧与影视学,2014,硕士.
[33]彭娜娜.胃得安联合四联疗法治疗Hp相关性DU的临床研究[D].青海大学,内科学,2012,硕士.
[34]邱东明.连铸电涡流型熔渣检测传感器激励源的研究[J].冶金自动化,1987,06:37-41.
[35]古晓辉.无线传感器网络中基于梯度的有网关分簇拓扑控制研究[D].郑州大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[36]徐海珠.元认知策略训练与高中生英语自主学习能力的培养[D].山东师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[37]马公拓.上海公交空调车的使用现状[J].城市公用事业.1998(02)
[38]朱英兰.尝试教学法在初中数学课堂中的实践研究[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[39]邓力.高温快速硫化丁腈橡胶物理性能的研究[D].上海工程技术大学,材料加工工程,2012,硕士.
[40]李文彬,郑宇,王晓鸣,房师欣.延时叠加震源对地表振动的数值仿真[J].石油地球物理勘探,2009,03:257-260+386+249.
[41]李唯楚.物管早期介入值得提出的几条建议[J].现代物业.2007(09)
[42]廖茂森.盐胁迫下花花柴miRNAs与靶基因相互作用研究[D].新疆大学,生物学,2013,硕士.
[43]但维宇.株洲市森林健康评价[D].中南林业科技大学,生态学,2014,硕士.
[44]王卉.玩家身份“同质异构”现象的分析与设计研究[D].华中师范大学,设计学,2014,硕士.
[45]谈耀.建立科学的人才评价体系，努力实现人的价值最大化——基于成都电信探讨如何提高国有企业的核心竞争力[D].西南交通大学,2002.
[46]黄海鹏.旋成体非光滑减阻表面设计理论及仿真研究[D].沈阳理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[47]曾杰.数字放映技术条件下电影院建筑工艺设计改进[D].重庆大学,建筑学（专业学位）,2014,硕士.
[48]何洁.新疆沙湾县乡村旅游发展现状与对策研究[D].华中师范大学,农村与区域发展,2014,硕士.
[49]罗长志.华支睾吸虫感染对肝切除术并发症的影响[D].广西医科大学,普通外科学（专业学位）,2013,硕士.
[50]孙作雷.大规模不规则环境中的移动机器人定位与地图构建[D].上海交通大学,2010.