天麦消渴片通过microRNA和mRNA调控网络改善糖代谢机制研究

【摘要】目的糖尿病严重危害人们的健康及生存质量。天麦消渴片和阿卡波糖在临床上表现出很好的降糖疗效。本研究旨在探讨天麦消渴片和阿卡波糖对糖尿病大鼠体重、血糖、血脂、胰岛素和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)等相关代谢指标的影响,并且利用全基因组表达谱芯片、miRNA表达谱芯片和实时定量RT-PCR探讨天麦消渴片和阿卡波糖降血糖的机制。方法(1)SD大鼠通过高脂饮食/注射STZ法构建糖尿病大鼠模型。72小时后,空腹血糖高于11.1mmol/L的SD大鼠判定为糖尿病模型建立成功。(2)将SD大鼠分为小剂量天麦消渴片组(8只,给予50mg/kg/d的天麦消渴片粉末悬浊液)、大剂量天麦消渴片组(8只,给予100mg/kg/d的天麦消渴片粉末悬浊液)、小剂量阿卡波糖组(30mg/kg/d)、大剂量阿卡波糖组(60mg/kg/d)、糖尿病模型组(8只,给予等体积生理盐水)和正常对照组(8只,给予等体积生理盐水),均连续灌胃8周。(3)每2周测定SD大鼠空腹血糖(FBG)和体重。7周末进行口服糖耐量实验(OGTT),测空腹和葡萄糖负荷后血糖和血浆GLP-1水平。8周末测定大鼠空腹血糖、血清胰岛素和血脂水平,观察天麦消渴片和阿卡波糖对糖尿病大鼠血糖和血脂的改善作用。(4)取大鼠骨骼肌组织进行全基因组表达谱芯片实验,取胰腺组织和小肠组织进行miRNA表达谱芯片实验,并运用实时定量RT-PCR验证芯片结果,以期探讨天麦消渴片和阿卡波糖对糖尿病大鼠降血糖的机制。结果(1)血糖结果：干预后,大剂量天麦消渴片组大鼠较糖尿病模型组空腹血糖(15.4±5.3mmol/Lvs24.1±2.5Inmol/L第2周,14.5±3.5vs25.3±3.1mmol/L第4周,16.3±4.3vs24.8±4.8mmol/L第6周,15.3±5.3vs23.6±4.3mmol/L第8周)和OGTT曲线下面积(AUC)(35.7±4.6vs53.7±3.4mmol/L,P<0.05)显著下降。干预后,大剂量阿卡波糖组较糖尿病模型组空腹血糖(14.6±4.3mmol/Lvs23.8±4.9mmol/L第2周,15.4±2.5vs23.0±4.6mmol/L第4周,14.7±4.6vs24.6±5.4mmol/L第6周,15.3±6.2vs23.7±4.9mmol/L第8周)和OGTT曲线下面积(AUC)(31.7±4.7vs52.6±6.3mmol/L,P<O.05)显著下降。(2)血清胰岛素结果：干预8周后,大剂量天麦消渴片组空腹血清胰岛素(FINS)(15.79±3.75vs31.90±4.68μIUU/mL,P<O.01)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR,15.83±4.87vs33.46±8.30)较糖尿病模型组显著降低(P<0.01)。大剂量天麦消渴片组胰岛β细胞分泌指数(HOMA-β,31.85±3.65vs21.92±2.46)较糖尿病模型组显著升高(P<0.01)。(3)糖负荷后血浆GLP-1结果：干预7周后,大剂量天麦消渴片组糖负荷后15分钟的血浆GLP-1(6.7±0.6vs5.7±0.3pmol/L)较糖尿病模型组显著升高(P<0.05)。(4)血脂结果：干预8周后,大剂量天麦消渴片组血总胆固醇(TC)(1.27±0.01vs1.44±0.01mmol/L)和甘油三酯(TG)(0.49±0.04vs0.83±0.05mmol/L)较糖尿病模型组显著降低(P<0.05)。(5)全基因组表达谱芯片结果：大剂量天麦消渴片组较糖尿病模型组有1752个基因表达上调,471个基因表达下调。基因分类分析(GO)和基因生物学功能通路分析(Kegg)等生物信息学分析显示,大剂量天麦消渴片组骨骼肌差异表达基因主要涉及三个通路：胰岛素信号通路、糖酵解/糖异生通路和三羧酸循环通路。实时定量RT-PCR结果显示,大剂量天麦消渴片组骨骼肌Akt1(胸腺病毒原癌基因1,fold-change=5.83±0.15)和Irs2(胰岛素受体底物2,3.62±0.021)基因较糖尿病模型组显著上调。大剂量天麦消渴片组骨骼肌Fox03(叉头框蛋白3,0.24±0.009)、Pck2(磷酸羧化酶,0.21±0.017)和Ptpnl(又称Ptplb,蛋白酪氨酸磷酸酶1B,0.34±0.013)基因较糖尿病模型组显著下调。(6)miRNA表达谱芯片结果：大剂量天麦消渴片组胰腺较糖尿病模型组有18个miRNA上调,3个miRNA下调。实时定量RT-PCR结果显示证实的这一结果。miRNA靶基因预测和通路分析结果揭示,天麦消渴片能上调胰腺miR-375和miR-30d,从而改善胰腺功能；通过miRNA,抑制胰腺炎症因子表达。大剂量阿卡波糖组小肠较糖尿病模型组有6个miRNA上调,2个miRNA下调。实时定量RT-PCR结果显示证实的这一结果。miRNA靶基因预测和通路分析结果揭示,阿卡波糖能通过激活miR-10a-5p和miR-664改善小肠MAPK通路和抑制炎症因子改善糖尿病大鼠糖代谢。结论(1)天麦消渴片不仅能有效降低糖尿病大鼠FBG,改善胰岛素敏感性,增加糖负荷后血浆GLP-1分泌,还能调节脂代谢。阿卡波糖能改善糖尿病大鼠血糖。(2)天麦消渴片可能是通过改善骨骼肌胰岛素信号通路、降低PCK2、Fox03和PTP-1B水平;上调胰腺miR-375和miR-30d水平,刺激胰岛β细胞增殖,抑制胰岛α细胞增殖,增加胰岛素基因表达；上调胰腺let-7b、let-7e、miR-142-5p和miR-375,抑制细胞因子及受体相互作用通路和MAPK通路的功能,从而改善糖尿病大鼠血糖和胰岛素抵抗状态。(3)阿卡波糖可能通过激活miR-10a-5p和miR-664改善小肠MAPK通路和抑制炎症因子改善糖尿病大鼠糖代谢。
【作者】张茜；
【导师】肖新华；
【作者基本信息】北京协和医学院，内分泌，2014，博士
【关键词】天麦消渴片；吡考啉酸铬；阿卡波糖；基因芯片；糖尿病；microRNA；

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