亚硒酸钠通过ROS/JNK/ATF2通路诱导白血病NB4细胞周期阻滞和凋亡的机制研究

【摘要】硒是人体内一种必需的微量元素,对身体健康、肿瘤的预防以及治疗都具有重要作用。大量实验表明,超营养剂量的硒可以有效诱导包括前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌、结肠癌、肺癌及白血病等在内的多种肿瘤细胞发生凋亡。其中,白血病(Leukemia)又称为血癌,是一种造血细胞的恶性增生性疾病,其致死率高,且目前的治疗方案还不尽如人意。因此,研究亚硒酸钠诱导白血病细胞凋亡的分子机制可以为含硒药物的研发以及白血病的治疗提供理论依据,并具有重要意义。本研究以亚硒酸钠为抗肿瘤药物诱导白血病细胞凋亡并探讨该过程的分子生物学机制。首先,我们通过流式细胞术和TUNEL染色实验验证硒可以以时间依赖的方式诱导白血病NB4细胞发生凋亡。与此同时,我们发现硒作用下,白血病细胞的DNA合成能力显著降低,且PI染色结合流式细胞术的方法发现硒可以导致NB4细胞被捕获在G0/G1期。Westernblot实验同样证实G0/G1期标志性蛋白在硒作用下发生显著下调且该过程伴随着JNK/ATF2信号通路的失活。在之后的实验中,我们进一步发现活性氧在硒处理NB4细胞后迅速上升,而在硒与活性氧清除剂联用后,硒所引起的细胞凋亡和细胞周期停滞被完全抑制。随后的Westernblot实验除了确定活性氧对于细胞凋亡及细胞周期进程相关蛋白的表达及活性调控作用外,还发现JNK/ATF2通路的抑制是活性氧的产生所造成的。进一步免疫共沉淀实验以及间接免疫荧光实验证实JNK与ATF2的确存在相互作用。且特异性抑制剂、siRNA干扰以及组成性活化JNK的实验均发现ATF2的抑制是JNK的失活所致,且活性氧作用下JNK的失活是CDK4、cyclinD3、cyclinA等细胞周期蛋白下调以及细胞凋亡发生的重要原因。在此基础上,染色质免疫共沉淀实验证明了ATF2可以结合在CDK4、cyclinD3和cyclinA的启动子区,且硒作用下ATF2与靶序列的结合明显减弱。siRNA干扰以及ATF2的过表达实验同样发现周期蛋白CDK4、cyclinD3、cyclinA的表达以及凋亡标志性蛋白caspase3和PARP的切割受到ATF2的调控,并最终确定ATF2具有促进NB4细胞周期进程以及抑制细胞凋亡的功能。最后,我们采用CDK4特异性抑制剂与亚硒酸钠联用,通过流式细胞术及westernblots实验证明CDK4的失活可加剧亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡。至此,我们的实验结果发现硒作用NB4细胞后产生活性氧通过抑制JNK/ATF2通路阻断NB4细胞周期进程并借此引发凋亡。最后,我们建立了白血病NB4细胞体外裸鼠异体移植瘤模型。TUNEL实验、HE染色结果显示亚硒酸钠在体内有促进肿瘤细胞死亡的作用。采用免疫组化的方法间接标记人白血病细胞表面抗原—CD33,并在裸鼠的肝和脾中检测CD33阳性细胞的变化情况,结果显示亚硒酸钠在体内具有抑制肿瘤细胞浸润和转移的功能。之后,我们提取了肿瘤组织的全蛋白样品,Westernblot实验结果证实JNK/ATF2通路、CDK4、cyclinD3、cyclinA、phosphoRb、PARP和caspase3在体内变化与细胞水平实验结果一致,免疫组化实验同样证实了上述结论。本研究发现了亚硒酸钠可以通过阻滞肿瘤细胞周期的进程进而导致细胞发生凋亡。由于这种机制的上游事件是活性氧,而活性氧正是众多抗肿瘤药物的作用机制,使之具有普遍的意义,同时也为亚硒酸钠用于临床提供了一个较好的理论基础和实验依据;此外,我们通过裸鼠异种移植瘤实验,在动物水平上证实了亚硒酸钠不仅可以诱导肿瘤细胞发生凋亡,亦可以抑制肿瘤细胞的浸润和转移,说明亚硒酸钠对白血病治疗具有潜在的临床应用价值,这也为白血病的治疗提供了理论依据。
【作者】安佳佳；
【导师】许彩民；
【作者基本信息】北京协和医学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】亚硒酸钠；活性氧；JNK；ATF2；细胞周期蛋白；凋亡；

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