AKAP10与汉族人群病窦综合征的关联研究及其新的突变型致病窦的机制研究

【摘要】缓慢性心律失常是临床上严重威胁人民健康的致死致残疾病之一,主要包括窦房结自律性受损和传导阻滞,临床上两者常常合并存在。其中,尤其以病窦综合征最为常见。病态窦房结综合征是因窦房结节律功能紊乱而导致的一种心律失常,每年因患病态窦房结综合征而做心脏起搏器手术的约占总心脏起搏器例数的50%。病态窦房结综合征在临床上主要表现为窦性心律不齐（过缓、过速或二者合并存在）,其病因多种多样,目前发病机制并不明确,人们对病窦综合征发病机制的认识主要集中在以下三个方面：（1）离子通道基因表达的改变；（2）窦房结细胞的减少；（3）结缔组织的主要成分的累积。其中,遗传因素导致的离子通道基因表达的改变多见于国外研究报道,如HCN4,SCN5A等突变导致的病窦家系的报道,然而,针对这些离子通道进行生物起搏的研究结果并不如预料的那么理想,这提示还有很多新的病窦相关基因有待发现。因此,对病窦综合征进行遗传学研究,有助于揭示疾病的致病机制,为发现病窦有效的治疗靶点和进行生物起搏研究提供依据。本课题运用分子生物学、细胞生物学、动物实验以及遗传学的手段,系统地探讨了一个A型激酶锚定蛋白AKAP10在病窦综合征的发病过程中的作用,并探讨了其分子机制。具体包括以下两部分研究结果：1.AKAP10与中国汉族人群病窦综合征的关联研究病窦综合征占植入心脏起搏器手术病因的一半以上,然而大多数病窦综合征的致病基因和机制尚不清楚。我们通过大量检索文献确定了4个跟心律失常发生密切相关的基因（AKAP10,Kcnj8,Cacnald,MIR-1）作为候选基因,利用PCR-SSCP和直接测序法确定了AKAP10的多个位点的改变与窦性停搏密切相关。我们首先收集了456例病态窦房结综合征的患者（其中包含227例窦性停搏患者）,467例对照样品,用PCR-SSCP筛选和直接测序法在窦性停搏患者中发现并鉴定了2个AKAP10新突变：位于Exon4的c.682687delAGAACT（p.Arg228Thr229del）和位于Intron6的c.1062-2A>G。而且通过关联分析的方法证实AKAP10中两个SNP位点rs203462和rs4925060与窦性停搏有统计学意义上的相关性。本研究首次在窦性停搏患者中发现AKAP10的多个位点（其中包含2个新的突变位点及2个SNP位点）改变,提示AKAP10这一基因可能参与了病窦综合征尤其是窦性停搏的发生发展。2.新的突变型AKAP10致病窦的机制研究我们构建AKAP10的微基因进行研究,发现并证明位于AKAP10Intron6的c.1062-2A>G突变可导致RNA剪接异常,造成EXON7的缺失,推测这可能是该突变导致病窦发生的机制。我们进一步对人的不同的细胞系包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,人主动脉平滑肌细胞（HASMC）,人单核细胞系（THP-1）以及多个患者的心肌组织,检测了AKAP10的转录本表达情况,首次发现人的AKAP10存在两个转录本（含有EXON7及缺失EXON7）,在不同的组织细胞中AKAP10表达的转录本情况是不同的,但是人的心肌中AKAP10只有一种转录本（含有EXON7）,提示这种缺失EXON7的转录本可能是导致病窦发生的机制,很有可能AKAP10不同的转录本的功能是不同的。为了从功能上证明位于Exon4的c.682687delAGAACT（p.Arg228Thr229del）AKAP10新突变可以导致病窦,我们课题组创建了国际上首个停跳状态下的早期（3dpf）斑马鱼心电图检测平台,并用注射RNA的方法在过表达p.Arg228Thr229del突变体的斑马鱼中成功模拟出窦性停搏样表型。我们进一步在HEK293A细胞中同时过表达p.Arg228Thr229del突变体和HCN4/HCN2,利用激光共聚焦显微镜检测到与野生型相比,突变型AKAP10（p.Arg228Thr229del）可以减弱HCN4的上膜,提示p.Arg228Thr229del突变体可能就是通过减弱HCN4的上膜影响了窦房结细胞膜HCN4的表达,使得起搏电流If减弱,从而导致了病窦的发生。综合两部分研究内容,我们通过对A型激酶锚定蛋白AKAP10的遗传分析和功能探讨,首次发现它对HCN4细胞膜表达的调控作用,提示AKAP10可能通过某种机制参与了窦房结细胞内HCN4的trafficking过程。该结果加深了我们对相关病窦综合征疾病发病机制的认识,并为病窦综合征的临床诊治提供了新的理论依据。
【作者】赵允梓；
【导师】张澍；田小利；
【作者基本信息】北京协和医学院，心血管内科学，2014，博士
【关键词】AKAP10；HCN2/4；窦性停搏；病窦综合征；trafficking；

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