新型光敏抗菌药物的研究

【摘要】近年来,由于抗生素的滥用导致了“超级细菌”(superbug)的出现和传播。所谓“超级细菌”是指这些细菌对于目前的抗生素具有多重耐药的特性,这对于临床创伤感染的治疗增添了很大的难度。且耐多重抗生素的超级细菌的爆发性流行尽管只是有潜在的可能,但其可怕之处却引起了世界各国的恐慌。因此发展新的抗感染策略迫在眉睫。光动力抗菌治疗方法(photodynamicantimicrobialchemotherapy,PACT)就是其中最具前景的新疗法之一,对于细菌、真菌和病毒引起的感染,特别是对于耐药菌感染均显示很好的疗效。光动力灭菌是基于光、光敏剂和氧三种因素协同作用的氧化损伤机制,不会因为单一用药、光敏剂的浓度、曝光时间不足等因素产生耐药问题。且超级细菌多发生在伤口、肺部以及血液和尿道中,除了血液感染外,其它部位采用PACT还是易于实现的,因而无论从耐药性、杀菌性以及效果和方便考虑,PACT均有很大的优势。PACT的关键是光敏药物。目前,国外利用不同光敏剂对不同细菌的光动力灭活作用进行了大量的探索,旨在发现理想的光敏药物。理想的抗菌光敏剂,应具有高效低毒和好的选择性,对细胞壁的通透性强,高效灭活微生物,而对于正常组织伤害较小。在国内外以往的文献报道中,作为抗菌的光敏药物选择性不够突出,有些对于革兰氏阳性菌有效,有些对革兰氏阴性菌有效,对于上述两类菌群均有效的高效光敏剂尚不多见,因而设计和发现可以有效治疗上述两类细菌的光敏药物,将会大大拓展PACT的应用。基于上述研究目标,我们开展了体内体外光敏抗菌药物的筛选,具体研究内容涵盖以下两部分：1.高效抗菌光敏剂的设计与筛选1.1水溶性糖酞菁类光敏剂的光动力抗菌作用研究酞菁类光敏剂有其特有的优势,但是水溶性差、易聚集的缺点限制了酞菁的使用。考虑到细菌代谢和繁殖较快,我们利用半乳糖作为修饰基团,不仅可以改善酞菁的水溶性、生物相容性,而且可以提高细菌的选择性摄取可使光敏药物优先聚集于细菌内而非周围组织或细胞中,从而实现选择性灭菌。研究结果表明：细菌对四种酞菁类化合物(T1-T4)的吞噬量在30min时达到最大,随着光照时间的延长,菌落数呈下降趋势,在能量密度达到6J/cm2后,灭活率达到最大,且细菌的灭活率不再随激光能量密度的增加而增加。在四种半乳糖取代的酞菁化合物(T1-T4)中,光照T1对革兰氏阳性耐药菌MRSA有很好的灭活作用且暗毒性较低,但对革兰氏阴性菌(绿脓杆菌和大肠杆菌)的灭活效果却很低。激光共聚焦显微成像显示MRSA对T1的吞噬量最多,T1的荧光最强。1.2卟啉类光敏剂的光动力抗菌作用研究由于半乳糖酞菁类光敏剂对革兰氏阳性菌有较好的杀菌效果,但对革兰氏阴性菌杀菌效率很低,极大的限制了此类光敏剂的使用。卟啉类化合物是源于天然的另外一类光敏剂,但其母核的光敏效率与选择性均不够理想,考虑到细菌的增长分化需要大量的碳源和氮源。我们选择双乙二胺为对原卟啉化合物进行修饰,得到一类新型的抗菌光敏剂。体外研究表明其对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌在体外均有高效的抗菌灭活作用,以小鼠急性创伤感染为模型的在体实验表明,双乙二胺的PACT作用可以明显的杀死绿脓杆菌,促进创伤面的愈合。双乙二胺光敏剂有其特有的抗菌优势,但是不稳定,见光容易分解的缺点限制了其使用。为了进一步研究氨基数目的取代关系对卟啉光敏剂的稳定性、生物活性的影响,本实验室对双乙二胺进一步设计,得到了五种氨基卟啉类化合物,体外实验表明：该五种卟啉类化合物PAl-PA5均具有较缓慢的光漂白率和较强的单线态氧产生能力,其中PA1的单线态氧产生率最高(0.69),高于四苯基卟啉(0.64),其余化合物PA1-PA4单线态氧产率在0.15-0.37之间。细胞吞噬实验表明MRSA,E.coli,P.aeruginosa在30min即对上述五种化合物的吞噬量达到最大。激光共聚焦显微成像显示上述三种菌株对五种化合物的吸收具有选择性,对化合物PAl-PA2吞噬较强,而对PA3-PA5吞噬却较弱。光敏抗菌实验表明PA1产生的灭菌效果较其他四种化合物好,对三种菌的MIC均为16μM,对MRSaA,E.coli的MBC为31μM,对P.aeruginosa的MBC为62.5μM。PAl的暗毒性也低(MBC>500μM)。利用菌落计数法检测了PA1-PA5对三种细菌的光反应、暗反应浓度曲线。结果表明随着浓度的增加,PA1表现出明显的杀菌效果,对MRSA的杀菌效果最强,当浓度为15.6μM时,全部杀死革兰氏阳性菌MRSA.当浓度上升为31.25μM时,PA1几乎能全部杀死E.coli,P.aeruginosa。但在此浓度范围内对3T3成纤维细胞的损伤却很小。以上结果表明PA1对革兰氏阳性菌及阴性菌均有很好的抗菌性能,可作为一种新型广谱的抗菌光敏剂使用,具有广阔的前景。2卟啉类抗菌光敏剂在皮肤感染类疾病中的光敏抗菌效果评价2.1光敏抗菌对创伤感染的效果评价皮肤破损性疾病是一种临床常见病、多发病,由于多重耐药细菌的出现,临床治疗面临很大的难度。以筛选出的苗头化合物PA1为研究对象,重点探讨PA1对由MRSA,E.coli,P.aeruginosa混合感染的大鼠创面模型的PACT作用,结果表明：PA1介导的PACT能促进大面积创伤感染的大鼠皮肤愈合.其机制可能与诱导bFGF,TGF-β1的高表达,促进创面纤维合成和重新分布有关。造模后4,10及14天,高剂量PACT组的bFGF和TGF-β1的表达最高,模型对照组最低(P<0.01).PACT能显著改善创面感染组织炎症状况,降低组织中炎症相关因子TNF-a和IL-6含量。减少创面组织中细菌的数量,加快创面愈合的速率。PACT的效果与PA1的浓度呈正相关,表现出较好的剂量依赖关系。大面积创伤发生时,由于屏障系统被破坏,细菌很容易穿透屏障,造成败血症。尽管PACT可以外用,体内却只能靠自身免疫力清除细菌,如果感染程度超过自身免疫力则容易引起败血症。基于这种考虑将PACT和抗生素的优势结合起来,PACT可以清除外表细菌,而体内细菌则由抗生素清除。基于大鼠创伤模型的实验表明：PACT联合抗生素治疗能显著降低大鼠大面积重度感染组织的炎症表达；减少创面组织中细菌数量,促进创面愈合,结果优于PACT治疗组和抗生素治疗组。PACT联合抗生素治疗大鼠大面积重度感染,死亡率为20%,而模型对照组的死亡率是60%,表明PACT联合抗生素治疗的有效性。免疫组化分析表明PACT联合抗生素治疗可显著提高创面组织中bFGF(?)TGF-β1的含量表达,促进创面纤维合成和重新分布,加快创面愈合的速率,同时显著降低创面组织中炎症相关因子TNF-α和IL-6含量,减少创伤组织的炎症反应,有助于创伤组织的修复。2.2光敏抗菌作用在烧伤感染中的效果评价烧烫伤(bums/scalds)是皮肤创伤的一种常见形式,为临床常见病和多发病。细菌感染是烧伤患者的主要并发症,发病率高,是造成病人死亡的主要因素,因此抗感染成为治疗烧伤病人的重要环节。PACT联合抗生素治疗大鼠Ⅲ度烧伤感染结果表明,PACT联合抗生素治疗能显著降低烧伤感染组织的炎症表达；减少创面组织中细菌数量,促进创面愈合,结果优于PACT治疗组和抗生素治疗组。(?)PACT联合抗生素治疗大鼠Ⅲ度烧伤感染,死亡率为0%,而模型对照组的死亡率是50%。免疫组合分析表明PACT联合抗生素治疗可显著提高创面组织中bFGF和新生血管数CD31的含量表达,促进血管新生和成纤维细胞的增殖,促进了创面肉芽组织的生长,从而促进创面愈合,同时可以提高机体的自身免疫能力显著降低烧伤创面组织中炎症相关因子TNF-α和IL-6含量,减少创伤组织的炎症反应,有助于创伤组织的修复。综上所述,PA1是一种具有良好抗菌效果的广谱光敏剂,体内、体外实验表明,该光敏剂具有高效、低毒的性质,可作为一种新型广谱的抗菌光敏剂使用,具有广阔的前景。
【作者】赵占娟；
【导师】刘天军；
【作者基本信息】北京协和医学院，药物化学，2014，博士
【关键词】光动力抗菌疗法；光敏剂；耐药菌；感染；创伤；烧伤；

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