乌拉尔甘草黄酮异戊烯基转移酶研究

【摘要】甘草(Licorice)为豆科植物乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralenisFisch.)、胀果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根及根茎,是我国最常用的中药材之一,具有补脾益气、清热解毒、化痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效。迄今为止已经从甘草中分离得到二百多种异戊烯基黄酮类化合物,药理研究表明这类化合物为甘草发挥药用活性的重要成分。异戊烯基转移酶介导在类黄酮母核上发生(C5)n异戊烯基Friedel-Crafts烷化反应,是这类化合物生物合成途径中的关键酶,但是甘草中黄酮异戊烯基转移酶研究还未见报道。植物黄酮异戊烯基转移酶为膜结合型蛋白,相关基因的寻找及外源表达困难,且严格的底物特异性也增加了体外功能鉴定的难度。目前为止已知功能的黄酮异戊烯基转移酶仅6个,远远少于天然存在的异戊烯基黄酮化合物,所以更多的黄酮异戊烯基转移酶有待挖掘,天然异戊烯基黄酮化合物的生物合成亟待阐明。基于上述研究背景,本文对甘草中的黄酮异戊烯基转移酶进行了深入研究,主要研究结果如下：1.甘草悬浮培养细胞／微粒体催化黄酮类化合物的异戊烯基化甘草悬浮细胞可以催化黄酮白杨素和芹菜素发生异戊烯基化反应；甘草细胞微粒体可以催化黄酮香叶木素、异黄酮2’-羟基染料木素、查尔酮类化合物异甘草素、4-羟基查尔酮、4’-羟基查尔酮、二氢查尔酮根皮素发生异戊烯基化反应。进一步研究还发现,诱导子茉莉酸甲酯可以上调异戊烯基转移酶的表达,表现为异戊烯基芹菜素产率的提高。甘草悬浮培养细胞／微粒体生物转化实验结果不仅表明了甘草中黄酮异戊烯基转移酶的存在,亦为后续异戊烯基转移酶底物的筛选提供依据。2.甘草异戊烯基转移酶基因的克隆及功能分析根据报道植物黄酮异戊烯基转移酶氨基酸序列保守区域设计3对简并引物进行RT-PCR扩增甘草中相关基因片段,并结合RACE技术获得了8条异戊烯基转移酶的cDNA全长。对全部异戊烯基转移酶基因的编码蛋白进行了深入的生物信息学分析。结果显示它们都具有植物异戊烯基转移酶的2个富含天冬氨酸的模序—NQXXDXXXD和KD(I/L)XDX(E/D)GD,N端含有导肽序列,均为9次跨膜蛋白,使用Mega进行系统进化树分析表明编码蛋白都处于植物黄酮异戊烯基转移酶的分支上(除GuPT5外)。运用酿酒酵母表达平台对异戊烯基转移酶进行功能研究,鉴定了其中4个酶的功能：GuA6DT特异催化黄酮芹菜素异戊烯基化,GuILDT特异催化查尔酮异甘草素异戊烯基化,GuPT2A-7特异催化异黄酮2’-羟基染料木素异戊烯基化,而GuPT5催化2,3-二羟基萘异戊烯基化。3.甘草异戊烯基转移酶GuA6DT选择性催化6-异戊烯基黄酮的生物合成GuA6DT选择性催化黄酮6位异戊烯基化,具有严格的底物特异性和位置选择性。利用不同结构类型的黄酮类化合物进行酶催化反应筛选并制备鉴定酶催化产物结构,初步明确了酶-底物作用关系：1)GuA6DT具有严格的底物特异性,仅能催化黄酮；2)异戊烯基化特异性地发生在6位,底物6位被占据时反应不能发生；3)5位和7位的羟基是发生异戊烯基化的必需基团；4)A环8位及C环3位取代影响反应的发生；5)B环的各种取代方式对异戊烯基化反应影响不大。GuA6DT的mRNA表达定量分析表明该基因在甘草的地上部分(叶和枝)中大量表达,具有很强的器官特异性,其表达高低与植物不同器官中6-异戊烯基芹菜素含量高低相一致,同时表明GuA6DT是甘草中催化6-异戊烯基黄酮生物合成的关键酶。另外,为探讨底物与黄酮异戊烯基转移酶的作用机制,并试图扩大酶作用的底物谱,构建了14对GuA6DT和另一已知底物谱较宽的黄酮异戊烯基转移酶SfFPT的嵌合体。嵌合体酶促反应结果显示仅其中2个嵌合体具有微弱的芹菜素异戊烯基化能力。对活性嵌合体进行区域结构分析,推测GuA6DT的第5次跨膜氨基酸序列在底物与酶的识别过程中起关键作用。4.异戊烯基查尔酮是异戊烯基黄酮化合物生物合成的重要中间体GuILDT是一个具有底物特异性的查尔酮异戊烯基转移酶。对A环或A’环上不同羟基取代形式的多种查尔酮均有异戊烯基化能力。通过对异甘草素、2,4-二羟基查尔酮和2,4,2’,4’-四羟基查尔酮的异戊烯基化产物进行分离纯化,确定异戊烯基化反应特异性地发生在A’环的3’位。查尔酮为黄酮类化合物的重要中间体,推测异戊烯基查尔酮也作为的中间体参与异戊烯基黄酮类化合物的生物合成。从甘草中获得查尔酮异构酶GuCHI以柚皮素查尔酮、异甘草素、2,4-二羟基查尔酮和2,4,2’,4’-四羟基查尔酮等简单查尔酮为底物环化生成相应的2S构型二氢黄酮,进一步还发现GuCHI可以催化它们的异戊烯基化衍生物生成异戊烯基二氢黄酮。本研究首次通过实验证实了异戊烯基二氢黄酮可以来源于异戊烯基查尔酮,为异戊烯基黄酮的生物合成研究提供了新思路。综上所述,本文系统地研究甘草中黄酮异戊烯基转移酶,获得8条异戊烯基转移酶基因并对鉴定了其中4条基因的功能,特别是GuA6DT催化黄酮6位异戊烯基化,GuILDT催化查尔酮3’位异戊烯基化；另外还发现：异戊烯基查尔酮可以作为异戊烯基二氢黄酮的中间体,在查尔酮异构酶等黄酮生物合成途径中相关酶催化下生成结构多样的异戊烯基黄酮,改变了异戊烯基是异戊烯基黄酮生物合成中最后步骤引入的传统认识。上述研究不仅为黄酮异戊烯基转移酶的结构及功能研究提供了科学依据,也为阐明甘草中异戊烯基黄酮的生物途径奠定了基础,同时还为活性异戊烯基黄酮的合成提供了新方法。
【作者】李建华；
【导师】戴均贵；
【作者基本信息】北京协和医学院，生药学，2014，博士
【关键词】甘草；黄酮异戊烯基转移酶；异戊烯基化；选择性催化；位置特异性；生物合成；查尔酮异构酶；

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